蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司 徐樂

Q-PCR（實時熒光定量PCR 技術(shù)）實現(xiàn)了在體外進行DNA 片段的擴增與定量的結(jié)合。本文提出一種基于光纖的熒光光路檢測系統(tǒng)，可以實現(xiàn)16 孔5 通道的熒光數(shù)據(jù)采集，簡單介紹了CCD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式與PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式，后采用價格更便宜的PD 結(jié)構(gòu)，設(shè)計熒光激發(fā)驅(qū)動光源電路、PD 電路、光路板，基于STM32H743VIT6 處理芯片可控制光源的亮滅，控制電機旋轉(zhuǎn)一周采集PD 光路信號。光路系統(tǒng)對16 孔樣品進行光路實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果表明：PCR 儀光路系統(tǒng)可以檢測16 孔，5 通道的熒光數(shù)據(jù)，空孔熒光波動小于5%，CT 不大于1，CV 不大于1.5%，能滿足PCR 光學(xué)需求，達到較好的應(yīng)用效果。

PCR 儀器是一種生物儀器（基因擴增），可以在體外借助多種酶對特定的DNA 片段進行快速的擴增。Q-PCR（實時熒光定量PCR 技術(shù)）[1,2]是在PCR 儀器所用的耗材中增加熒光物質(zhì)，在PCR 工作過程里DNA在不斷地擴增，熒光信號也隨之增強，通過檢測熒光信號，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以對DNA 進行定量、定性的分析。

PCR 擴增分為4 個時期，分別為基線期（基線期DNA 進行指數(shù)擴增，DNA 數(shù)量小及熒光信號較弱）、指數(shù)擴增期（指數(shù)擴增期DNA 進行指數(shù)擴增，DNA 數(shù)量及熒光信號進行指數(shù)增強）、線性增長（DNA 沒有進行指數(shù)擴增）以及平臺期（DNA 數(shù)量穩(wěn)定）。在指數(shù)增長期，熒光擴增產(chǎn)物DNA 分子總數(shù)量y=x（1+e）n，x為原始模板DNA 分子數(shù)量，公式中的指數(shù)n表示PCR 反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，e表示PCR 擴增的效率（0 ≤e≤1）。由于基線期與指數(shù)擴增期具有指數(shù)擴增關(guān)系，可以進行精確的定量檢測，通過PCR 儀器檢測樣品熒光信號，將閾值線定到指數(shù)擴增期，可以實現(xiàn)對DNA 起始模板量的定量檢測分析。

1 光學(xué)系統(tǒng)原理

實時熒光定量PCR 儀熒光檢測系統(tǒng)由激發(fā)光系統(tǒng)、檢測光系統(tǒng)組成。

CCD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)，采用鹵素?zé)糇鳛榧ぐl(fā)光源，激發(fā)光系統(tǒng)還包括濾光片、光纖。檢測光系統(tǒng)是由CCD相機、濾光片、光纖、多元鏡組成。鹵素?zé)艚?jīng)過濾光片傳到前端光纖，到反應(yīng)孔，經(jīng)過光纖孔板上的熒光試劑，再經(jīng)過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后CCD 相機采集熒光信號（需要調(diào)節(jié)CCD 定位、設(shè)置曝光時間等操作）。檢測熒光波長范圍由380nm ～780nm，F(xiàn)AM 激發(fā)波長470nm±10nm，檢測波長520nm±10nm；VIC 激發(fā)波長525nm±10nm，檢測波長570nm±10nm；ROX 激發(fā)波長570nm±10nm，檢測波長620nm±10nm；CY5 激發(fā)波長630nm±10nm，檢測波長670nm±10nm；CY5.5激發(fā)波長680nm±10nm，檢測波長710nm±10nm。

如圖1 所示是PD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)[3]，由激發(fā)光系統(tǒng)與檢測光系統(tǒng)組成。激發(fā)光系統(tǒng)由LED 燈、濾光片、光纖組成，檢測光系統(tǒng)由PD、濾光片、光纖、多元鏡組成。選擇激發(fā)波長范圍380nm ～780nm 的LED 燈經(jīng)過濾光片傳到前端光纖，到反應(yīng)孔，經(jīng)過光纖孔板上的熒光試劑，再經(jīng)過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后PD 將熒光光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為模擬信號送入至光路板進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。

圖1 16 孔5 通道PD 架構(gòu)光學(xué)系統(tǒng)Fig.1 16-hole 5-channel PD architecture optical system

如圖2 所示是采用PD 類型的光學(xué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)盤圖。PD 類型的光學(xué)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)分為固定盤與轉(zhuǎn)盤。圓盤為旋轉(zhuǎn)盤，內(nèi)圈為LED 燈通道，外圈為PD 檢測通道；上面與步進電機固定的盤為固定盤，外圈16 孔用于檢測（與旋轉(zhuǎn)盤外圈相對應(yīng)），插入光纖通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤方式有序掃描光路信號，內(nèi)圈16 孔插入光纖用于激發(fā)（與旋轉(zhuǎn)盤內(nèi)圈相對應(yīng)），發(fā)射與檢測光路孔的配對數(shù)及為所能檢測的樣本孔數(shù)，LED 與PD 的配對數(shù)及為所能檢測樣本的通道數(shù)，后期可以通過改動旋轉(zhuǎn)盤里L(fēng)ED 與PD 配對數(shù)可以擴展通道、變化固定盤孔的個數(shù)可以擴展樣本孔數(shù)。

圖2 PD 架構(gòu)旋轉(zhuǎn)圖Fig.2 PD architecture rotation diagram

轉(zhuǎn)盤帶有原點復(fù)位功能，轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)一圈就是測試一輪光路信號，采用步進電機驅(qū)動的方式，16 細分及步進電機走3200 步轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)一圈。將采集到的20 步光學(xué)數(shù)據(jù)通過排序，濾波取最大的四個數(shù)做平均得出光強，定位圓盤復(fù)位點需注意傳感器的觸發(fā)區(qū)域為連續(xù)區(qū)域，整個區(qū)域約25 步(一圈3200 步)，在圓盤設(shè)計時，盡量避免孔對準(zhǔn)位置在復(fù)位區(qū)域。

2 光學(xué)電路設(shè)計

2.1 PD 型光學(xué)檢測系統(tǒng)原理

如圖3 所示為PD 型熒光檢測系統(tǒng)圖，中位機發(fā)送采光指令給光路板，光路板開始開燈、控制電機、轉(zhuǎn)換處理PD 信號，電機回到原點關(guān)燈、停止電機運動、停止處理PD 信號、發(fā)送數(shù)據(jù)。

圖3 PD 型熒光檢測系統(tǒng)圖Fig.3 PD fluorescence detection system diagram

2.2 光路板電路設(shè)計

光路板采用STM32H743VIT6 主控芯片，包括SWD燒錄接口、25MHz 有源晶振、復(fù)位電路、EEPROM 采用AT24C128 用于存儲數(shù)據(jù)的功能、運用16 位ADC1，可以采集6 個PD 信號、可控制6 路LED 燈的亮與滅、控制步進電機的PWM 占空比與使能信號、接收原點復(fù)位信號、與中位機進行通信功能。

光路板LED 恒流驅(qū)動電路，通過PS2801 光耦芯片將單片機數(shù)字信號與LED 燈使能信號隔離，弱信號控制LED 燈的亮與滅，單片機信號沒有或者信號為高時LED燈不使能，單片機信號為低電平時LED 燈使能點亮。

PD 電路板輸出的模擬信號經(jīng)過ADA4522 運算放大器放大,每路放大比例需根據(jù)實際光路進行調(diào)整，由于單片機參考電壓不能超過4V，運放供電電壓大于4V，對運放輸出進行了分壓，使單片機最大接收電壓不超過3V，滿足各芯片對電壓的需求。

2.3 PD 板設(shè)計

選用濱松品牌規(guī)格為S6931，濱松生產(chǎn)的PD 批次間較好，還具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、噪聲低的優(yōu)點。光譜響應(yīng)范圍為320nm ～1000nm，暗電流只有20pA，上升時間0.5us。

輸出電流IOUT=IDARK+IPD，IDARK為PD 感光電流，IPD為暗電流（噪聲）。光電二極管有兩種工作模式，分別為光伏、光電導(dǎo)，在光伏模式工作時，二極管無偏置，暗電流可以達到最小；光電導(dǎo)模式工作時，需要施加一個外部反向電壓，可以提高響應(yīng)速度。本文基于對光電二極管的應(yīng)用速度、暗電流的考慮，選擇光電二極管在光伏模式下工作。

3 光學(xué)下位機軟件設(shè)計

光路板單片機上電初始化（開啟時鐘、ADC1 外設(shè)6通道使能，DMA1 將AD 采集數(shù)據(jù)存儲到指定內(nèi)存、電機復(fù)位等），判斷是否接收到采光指令，沒有收到繼續(xù)等待，如果收到正確信息啟動電機運動、開始采集處理熒光數(shù)據(jù)、電機運動一圈回到原點或者采光過程中復(fù)位超時、電機超3200 步，關(guān)閉電機、原點標(biāo)志復(fù)位、處理好光路和狀態(tài)數(shù)據(jù)發(fā)送給中位機。

4 光路實驗

對PD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)進行光路實驗，驗證光學(xué)系統(tǒng)能否工作。進行5 色實驗時，光學(xué)系統(tǒng)需要借助溫度控制模塊、中位機（帶液晶屏的平板），分別測試5 個通道FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5 的16 孔 位 數(shù) 據(jù)，如表1 所示。

表1 光學(xué)實驗數(shù)據(jù)分析表Tab.1 Analysis table of optical experiment data

測試4 個通道FAM、VIC、ROX、CY5 的A1、A4、B5、B8 孔位數(shù)據(jù)、測試第五通道CY5.5 的A5、A8、B1、B4 孔位數(shù)據(jù)。FAM 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：3103-6706，擴增效率：2.16；VIC 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位數(shù)據(jù)：3738-8288，擴增效率：2.22；ROX通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：1997-9976，擴增效率：5.00；CY5 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：2543-8402，擴增效率：3.30；CY5.5 通道（測試A5、A8、B1、B4 孔位）：7821-31534，擴增效率：4.03。

通過表1 的數(shù)據(jù)，所計算的CT 值小于1，CV 值小于1.5%，光路系統(tǒng)滿足PCR 儀器的光路要求。

5 結(jié)論

本文闡述了Q-PCR 儀擴增原理，后簡單介紹了CCD結(jié)構(gòu)的光路檢測方式與PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式，PD 結(jié)構(gòu)由于價格便宜容易操作，提出了基于PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)盤掃描方式，設(shè)計熒光激發(fā)驅(qū)動光源電路、PD 電路、光路板，可以實現(xiàn)16 孔5 通道的熒光數(shù)據(jù)采集（可以通過改動轉(zhuǎn)盤升級6 通道）。運用設(shè)計的光路系統(tǒng)對16 孔樣品進行光路實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果表明：所設(shè)計的光路系統(tǒng)采集熒光信號平穩(wěn)，可以檢測16 孔，5通道的熒光數(shù)據(jù)，空孔熒光波動小于5%，4 個孔位光路數(shù)據(jù)，CT 值小于1，CV 值小于1.5%，可以滿足實時熒光定量PCR 儀的光學(xué)需求[4]。

引用

[1] 鐘珂珂.光纖型定量PCR儀熒光檢測系統(tǒng)研究[D].杭州.浙江大學(xué),2013.

[2] 毛賀.光纖型定量PCR儀熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)性能研究[J].機電工程技術(shù),2016,45(11):54-56.

[3] 王偉平.96孔實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)的開發(fā)[D].杭州.浙江工業(yè)大學(xué),2011.

[4] 梁子英,劉芳.實時熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2020(6):1-3+8.