史敏晶，張世鑫，丁 歡，蔣 毅,2，田維敏*

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101；2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell. Arg.，以下簡稱橡膠樹）是最重要的人工栽培多年生產(chǎn)膠植物，為世界所需天然橡膠的主要來源[1]。橡膠樹樹皮中的乳管作為天然橡膠合成和儲存的特異組織，與天然橡膠的生產(chǎn)息息相關(guān)。割膠是當(dāng)前從橡膠樹乳管組織中獲取天然橡膠的唯一途徑，割膠后橡膠樹乳管的排膠速度和排膠時(shí)間直接決定著膠乳的產(chǎn)量。因此，割膠后的排膠機(jī)理一直受到研究者的極大重視[2-5]。

橡膠樹成熟乳管的封閉性結(jié)構(gòu)和特殊的內(nèi)含物導(dǎo)致了完整的乳管內(nèi)部存在極高的膨壓，高達(dá)10~15個(gè)大氣壓[6-7]，割膠后開放的割口壓力與外界大氣壓相同，因此由外到內(nèi)逐步增加形成一個(gè)壓力梯度，這一壓力梯度驅(qū)動(dòng)膠乳向外涌流，形成了膠乳外排初始階段的主動(dòng)力?？梢姡鹉z樹的膨壓與排膠密切相關(guān)。已有研究表明，細(xì)胞壁的彈性在維持細(xì)胞膨壓中具有重要作用[8-9]，彈性越好能維持的膨壓也越高；細(xì)胞壁的硬度和剛性越大，則膨壓越低[10-11]，而細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征決定其彈性和剛性、硬度。細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞最重要的特征結(jié)構(gòu)，也是最早被觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在很長的一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是一成不變的簡單結(jié)構(gòu)，隨著科學(xué)的發(fā)展其作為一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)才被認(rèn)識到[12]。植物化學(xué)分析表明，纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和木質(zhì)素等構(gòu)成了細(xì)胞壁的主要成分，并在不同物種、組織、細(xì)胞類型中含量和結(jié)構(gòu)都有差別[13]。木質(zhì)素作為植物體中僅次于纖維素的第二大有機(jī)物質(zhì)，其在細(xì)胞壁中含量的高低被證明對植物木材細(xì)胞的彈性和硬度有顯著影響[14]，進(jìn)而影響膨壓[15]。晁金泉等[16]研究發(fā)現(xiàn)排膠通暢的橡膠樹無性系RY8-79的樹皮內(nèi)層木質(zhì)素的含量低于排膠凝滯的無性系PR107，而AN等[17]證明RY8-79的膨壓明顯高于PR107，可見在橡膠樹樹皮中木質(zhì)素含量的高低與膨壓之間存在關(guān)聯(lián)。目前，對橡膠樹樹皮組織木質(zhì)素的定位研究缺乏，尋找一種簡單、直觀顯示樹皮中木質(zhì)素的方法對于分析其膨壓的高低，以及比較不同品系木質(zhì)素含量差異與排膠特性之間的關(guān)系都具有重要的意義。

植物木質(zhì)素的顯示方法目前主要有組織化學(xué)染色、熒光顯微鏡技術(shù)、共聚焦拉曼顯微鏡以及透射電鏡等[18-24]，其中組織化學(xué)染色簡單、快捷，所以在木質(zhì)素定位分析中應(yīng)用較為廣泛[25]。本研究以RY8-79和PR107成齡橡膠樹樹皮為研究材料，采用石蠟切片結(jié)合木質(zhì)素組織化學(xué)染色，比較分析了Wiesner反應(yīng)方法（間苯三酚法）、M?ule反應(yīng)方法（高錳酸鉀染色法）以及番紅染色結(jié)合熒光顯示木質(zhì)素的方法，旨在探尋一種適合定位分析橡膠樹樹皮木質(zhì)素的方法，為研究橡膠樹排膠膨壓以及種質(zhì)鑒定分析提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州南辰農(nóng)場（海南儋州寶島新村）7年生的RY8-79和PR107成齡健康橡膠樹各3株，于樹高1.5 m處用打孔器采集樹皮，單面刀片分割成0.5 cm×1.0 cm左右的組織小塊，80%（V/V）酒精固定備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 制備石蠟切片所需的乙醇、正丁醇、冰醋酸、二甲苯為國產(chǎn)分析純；高錳酸鉀購自國藥集團(tuán)；木質(zhì)素染色液（間苯三酚法）購自上海源葉生物科技有限公司；石蠟為生物組織切片專用，光學(xué)顯微鏡為德國Leica DMLB型。

1.2 方法

1.2.1 光學(xué)顯微切片的制備 用于木質(zhì)素染色的樹皮材料分割后經(jīng)80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脫水，正丁醇透明，石蠟包埋，具體方法參照常規(guī)石蠟切片方法。用于顯示乳管的樹皮材料則經(jīng)80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脫水后，需碘-溴冰醋酸試劑60 ℃處理36 h，然后乙醇脫水后經(jīng)正丁醇透明并石蠟包埋，具體方法參見史自強(qiáng)等[26]的方法并稍作修改。石蠟切片厚度10~20 μm。

1.2.2 Wiesner反應(yīng) 即鹽酸-間苯三酚染色法，染色步驟主要是：切片材料經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精梯度復(fù)水后，滴加溶于95%乙醇的2%間苯三酚（A液）數(shù)滴，孵育幾分鐘后加入等量的12%鹽酸（B液），封片，在顯微鏡可見光下觀察拍照。

1.2.3 M?ule反應(yīng) 即高錳酸鉀（KMnO4）染色法，染色步驟主要是：切片材料經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精梯度復(fù)水后，用0.5% KMnO4（W/V，水劑）染色5 min，蒸餾水漂洗后加入12%鹽酸（V/V）浸泡1 min，然后用29%氨水（V/V）封片，顯微鏡可見光下觀察拍照。

1.2.4 番紅染色反應(yīng) 切片材料二甲苯脫蠟后酒精梯度復(fù)水，1%番紅水溶液（W/V，水劑）染色2 h，蒸餾水漂洗5 min，75%酒精漂洗5 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡下，分別于可見光和546 nm綠色熒光激發(fā)光源下觀察成像。

1.2.5 固綠染色 經(jīng)碘-溴染色處理后的切片材料二甲苯脫蠟后固綠染色1 h，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡Leica DMLB下觀察乳管的位置并成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹無性系PR107樹皮不同染色方法木質(zhì)素定位分析

橡膠樹無性系PR107的樹皮組織在不同的木質(zhì)素染色方法下顯示結(jié)果有差異。Wiesner正反應(yīng)顏色為紅色，但在橡膠樹PR107的樹皮組織中顯色不明顯，尤其在形成層區(qū)、水囊皮和黃皮層這些軟樹皮中呈現(xiàn)紅色的木質(zhì)素基本不可見，僅在靠近形成層和水囊皮的中部有2列顏色相對較深的區(qū)域，但也無紅色顯示（圖1A）。對顏色較重的區(qū)域放大觀察，也未見明顯的紅色呈現(xiàn)（圖1B）。這些結(jié)果表明，Wiesner顯色反應(yīng)對橡膠樹樹皮薄壁組織的染色效果較差，同時(shí)也說明這些部位木質(zhì)素沉積較少。M?ule染色木質(zhì)素正反應(yīng)為姜黃色，樹皮中在靠近形成層和水囊皮中部有2列顏色相對較深的區(qū)域，主要表現(xiàn)為黃褐色（圖1C）。由放大圖可知，不同類型細(xì)胞染色有一定的區(qū)別，同一細(xì)胞內(nèi)染色深的部位主要定位在細(xì)胞角隅處，除了細(xì)胞壁外，細(xì)胞的內(nèi)含物也有染色；射線作為典型的薄壁細(xì)胞，染色相較有次生加厚的篩管更為明顯（圖1D）?？梢姡谙鹉z樹中這種染色方法的特異性不是很強(qiáng)，其他物質(zhì)也能被染色從而對木質(zhì)素的定位存在干擾。另外，M?ule染色導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，可能是染色過程中使用的強(qiáng)酸和強(qiáng)氧化劑對細(xì)胞組織存在破壞作用。番紅染色的明場觀察，切片中有少許部位被染成淡紫紅色，在靠近形成層和水囊皮中部有2列顏色相對較深的區(qū)域（圖1E）。局部放大結(jié)果表明，這2列相對深色區(qū)域在細(xì)胞壁尤其是角隅處有較明顯的紫紅色（圖1F）。番紅染色后利用綠光激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察到清晰的紅色熒光，紅色熒光分布的強(qiáng)弱與可見光下3種方法染色深淺部位基本一致，且不同類型細(xì)胞紅色熒光區(qū)分明顯（圖1G~圖 1H）。在低倍鏡和高倍鏡下形成層區(qū)域紅色熒光都極弱，基本為背景色；射線細(xì)胞的熒光明顯弱于篩管等維管組織；石細(xì)胞中含大量木質(zhì)素，熒光極強(qiáng)，符合已知細(xì)胞類型對應(yīng)的木質(zhì)素含量的常識。熒光顯示的結(jié)果中，具有明顯熒光的部位均為細(xì)胞壁，尤其是角隅處，細(xì)胞內(nèi)含物中無染色干擾，可見番紅結(jié)合熒光顯示效果好且特異性好。

2.2 橡膠樹無性系RY8-79不同染色方法木質(zhì)素定位分析

橡膠樹無性系RY8-79的樹皮組織在Wiesner中顯色不明顯，在形成層區(qū)、水囊皮和黃皮層等軟樹皮中未觀察到明顯的木質(zhì)素陽性染色（圖2A）。對顏色略重的區(qū)域放大觀察，不同的細(xì)胞類型之間未見明顯的染色差異（圖2B），這些結(jié)果表明RY8-79的樹皮組織對Wiesner的顯色反應(yīng)較差且木質(zhì)素沉積少。M?ule染色后軟樹皮中有幾列黃褐色顏色相對較深的區(qū)域（圖 2C），但放大后未觀察到細(xì)胞壁等處有明顯染色（圖2D）。另外，細(xì)胞內(nèi)含物也有強(qiáng)烈染色，從而對木質(zhì)素的定位存在干擾。番紅染色可見光觀察發(fā)現(xiàn)，切片中染色極淺（圖2E），局部放大結(jié)果表明，組織細(xì)胞壁及其角隅處均無明顯的紫紅色（圖2F）。相同的組織切片經(jīng)綠光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下可觀察到有強(qiáng)弱區(qū)分的紅色熒光，其紅色熒光強(qiáng)的位置與可見光下3種方法染色較深的部位基本一致（圖2G~圖2H）。

圖2 RY8-79樹皮不同木質(zhì)素染色方法比較分析Fig. 2 Comparison of different staining methods for lignin in bark of RY8-79

由可見光明場下3種木質(zhì)素顯示方法的結(jié)果可知，無論P(yáng)R107還是RY8-79，染色深的部位在不同顯色方法中基本一致，表明該區(qū)域的確是木質(zhì)素含量較高的組織。但染色整體都偏淺淡，不同類型細(xì)胞差異不明顯，表明在橡膠樹樹皮薄壁細(xì)胞中木質(zhì)素含量不高。強(qiáng)熒光的組織部位與可見光下染色深的部位基本一致，但熒光下不同類型細(xì)胞之間可以觀察到較明顯的差異，且熒光清晰，能很好地顯示木質(zhì)素在不同位置的含量高低，結(jié)合其良好的特異性，番紅染色后熒光觀察是最適合橡膠樹樹皮組織細(xì)胞的木質(zhì)素定位的方法。

PR107和RY8-79是2種具有不同排膠特性的種質(zhì)，木質(zhì)素?zé)晒庠赑R107中明顯強(qiáng)于RY8-79，可見PR107的木質(zhì)素含量明顯高于RY8-79。

2.3 橡膠樹無性系PR107和RY8-79中乳管列的分布

經(jīng)碘-溴染色后，次生乳管列中的天然橡膠顯示為黑褐色，與其他組織細(xì)胞存在明顯區(qū)別（圖3）。PR107樹皮組織中可以觀察到形成層外側(cè)一列明顯的乳管，水囊皮中也有一列乳管，黃皮層中的一列連貫性略差的乳管，其他靠近砂皮層的乳管因分散而不能形成明顯的列狀；石細(xì)胞較多，形成石細(xì)胞列（圖3A）。RY8-79在形成層外側(cè)僅見一小段乳管列，水囊皮中有2列乳管，黃皮層中乳管較多，但排列較雜亂；石細(xì)胞數(shù)量少（圖3B）。將PR107和RY8-79中乳管列的分布與木質(zhì)素的定位進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)乳管列所在的區(qū)域木質(zhì)素含量較高，二者表現(xiàn)出高度的重合。在每個(gè)乳管列分布的區(qū)域，PR107通常有多層細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)木質(zhì)素?zé)晒猓▓D1H），而RY8-79普遍僅一列細(xì)胞表現(xiàn)較強(qiáng)熒光（圖2H）。

圖3 PR107和RY8-79樹皮中的次生乳管細(xì)胞分析Fig. 3 Analysis of secondary laticifer in bark of PR107 and RY8-79

3 討論

木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分之一，其在細(xì)胞壁中含量的高低被證明與植物細(xì)胞的彈性和硬度有關(guān)，并影響膨壓[14-15]。橡膠樹乳管內(nèi)部膨壓高達(dá)10~15個(gè)大氣壓，割膠后由外到內(nèi)形成的壓力梯度是膠乳外排的初始主動(dòng)力。膨壓對于橡膠樹排膠至關(guān)重要，但目前橡膠樹中關(guān)于膨壓的研究較少，而膨壓大小與木質(zhì)素含量高低的關(guān)系目前尚不清楚。晁金泉等[16]通過乙酰溴法測定得出RY8-79樹皮內(nèi)層木質(zhì)素含量低于PR107，而AN等[17]證明RY8-79的膨壓高于PR107，由此推測橡膠樹樹皮中木質(zhì)素含量的高低與膨壓大小可能呈負(fù)相關(guān)。乙酰溴法測定木質(zhì)素含量需要用到高氯酸等?；苤圃噭?，并且方法比較繁瑣，利用染色方法對橡膠樹樹皮組織中的木質(zhì)素進(jìn)行定位研究則能更為直觀地顯示樹皮中木質(zhì)素含量的高低，但目前缺乏這方面的研究。

通過比較Wiesner反應(yīng)方法（間苯三酚法）、M?ule反應(yīng)方法（高錳酸鉀染色法）以及番紅染色結(jié)合熒光顯示木質(zhì)素等幾種組織化學(xué)染色方法，發(fā)現(xiàn)橡膠樹樹皮染色較深的部位在幾種方法中是一致的，表明這些位置木質(zhì)素的含量的確高于其他的部位。整體來看，橡膠樹軟樹皮中細(xì)胞木質(zhì)素染色是很淺的，表明在軟樹皮中木質(zhì)素總體含量不高。針對木質(zhì)素含量不高的這些薄壁組織，染色方法的靈敏度對于區(qū)分不同組織或者不同種質(zhì)木質(zhì)素含量高低顯得尤為重要。本研究結(jié)果表明番紅染色結(jié)合熒光定位木質(zhì)素的效果是最好的，不同組織之間能觀察到明顯的差異。其中，形成層區(qū)作為分生組織，細(xì)胞正在分化發(fā)育中，次生細(xì)胞壁的合成弱，木質(zhì)素含量應(yīng)最低，在熒光下觀察，形成層區(qū)的確熒光最弱。PR107中木質(zhì)素的熒光明顯強(qiáng)于RY8-79，表明PR107中的木質(zhì)素含量高于RY8-79，這一結(jié)果與晁金泉等[16]測定的結(jié)果一致。另外，Wiesner反應(yīng)方法（間苯三酚法）和M?ule反應(yīng)方法（高錳酸鉀染色法）相較番紅染色，染色過程中需要用到管制藥品間苯三酚和強(qiáng)氧化劑KMnO4，以及具有腐蝕性的強(qiáng)酸試劑鹽酸和刺激性試劑氨水，這些試劑不僅對操作人員有毒副作用，而且對顯微鏡尤其是物鏡鏡頭也有一定的損傷。經(jīng)比較分析，番紅染色結(jié)合熒光顯示木質(zhì)素是目前適合橡膠樹樹皮組織分析的一種簡便、安全的方法。本方法的建立不僅有利于通過研究木質(zhì)素含量差異從而分析橡膠樹的排膠特性，對于橡膠樹種質(zhì)的鑒定也有參考價(jià)值。

本研究通過比較樹皮中乳管列的位置和強(qiáng)木質(zhì)素?zé)晒獾牟课?，首次發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量高的位置與乳管列分布的位置高度吻合，這一特征在PR107和RY8-79中都存在，由此推測在軟樹皮中主要是乳管細(xì)胞及其周圍的細(xì)胞木質(zhì)素含量較高，這可能與保護(hù)高膨壓的乳管有關(guān)。相對PR107，RY8-79中膨壓更高，但周圍細(xì)胞木質(zhì)素含量偏低，這也可能是生產(chǎn)中RY8-79更容易爆皮流膠的原因之一。

橡膠樹樹皮中分布大量石細(xì)胞[1,27]，作為一種典型的木質(zhì)化加厚的厚壁組織，史敏晶等[27]研究認(rèn)為石細(xì)胞的分布具有品系特征，且發(fā)現(xiàn)PR107的石細(xì)胞分布明顯高于RY8-79，而本研究的定位分析表明軟樹皮中PR107的木質(zhì)素分布也高于RY8-79，薄壁細(xì)胞中的木質(zhì)素含量高低是否與石細(xì)胞多少之間有對應(yīng)關(guān)系也值得進(jìn)一步分析。石細(xì)胞由于其特殊的結(jié)構(gòu)特征，容易識別，如果能建立石細(xì)胞數(shù)量和木質(zhì)素含量之間的相關(guān)關(guān)系，那么，通過石細(xì)胞的多少間接分析木質(zhì)素含量高低對于大規(guī)模、快速鑒定和篩選木質(zhì)素含量高低的品系則具有重要的意義。