滕 鑫,楊正軒,王 媛,倪云峰,陳德鳳,王 艷,贠俊茹,王 娟

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院,陜西 西安 710038)

近年來,肺癌已成為癌癥死亡的主要原因之一,其中80% 以上的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)[1]。由于NSCLC的5年生存率低且復(fù)發(fā)率高,因此進(jìn)一步了解NSCLC發(fā)生的分子機(jī)制,尋找新的早期診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA,在癌癥的進(jìn)展中起著重要作用[3]。Li等[4]通過整合32個(gè)miRNA表達(dá)譜,比較了NSCLC組織和正常肺組織中差異表達(dá)的miRNA,發(fā)現(xiàn)miR-96-5p在NSCLC中表達(dá)上調(diào),并在腫瘤癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗(yàn)證。在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中,抑癌基因如p53和磷酸酯酶與張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表達(dá)常受到抑制或基因易發(fā)生突變[5-6]。PTEN是參與腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵抑制因子。研究[7-8]發(fā)現(xiàn),一些調(diào)控癌癥的miRNA如miR-21和miR-200c直接靶向PTEN,然而,在NSCLC中miRNA調(diào)控PTEN的機(jī)制仍不清楚。本研究旨在進(jìn)一步探討miR-96-5p靶向PTEN對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的作用及分子機(jī)制,為NSCLC的防治尋找潛在靶點(diǎn)和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549購自武漢普諾賽生命科技有限公司。RIPA裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、結(jié)晶紫染色液、CCK-8試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司;PTEN小干擾RNA(si-PTEN)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-96-5p類似物(miR-96-5p mimics)及其陰性對(duì)照(NC mimics)和 miR-96-5p抑制劑(miR-96-5p inhibitor)及其陰性對(duì)照(NC inhibitor)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;Ham’s F-12K培養(yǎng)基及優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自美國Gibco公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測試劑盒購自南京諾維贊生物科技股份有限公司;Trizol 試劑、熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于美國 Thermo Fisher Scientific公司;Anti-PTEN antibody、Anti-Akt(phospho T308)antibody、Anti-Akt antibody、Anti-β-actin antibody、Anti-rabbit/mouse IgG HRP-linked Antibody購自美國 Abcam 公司。RT-qPCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549采用含10% 胎牛血清及1%雙抗(青霉素100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml)的Ham’s F-12K培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種于6孔板的細(xì)胞培養(yǎng)至70%融合,將miR-96-5p mimics、NC mimics、miR-96-5p inhibitor、NC inhibitor、WT-PTEN、Mut-PTEN使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后收集細(xì)胞驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染組分為:①miR-96-5p mimics組;② NC mimics組;③miR-96-5p inhibitor組;④NC inhibitor組;⑤miR-96-5p inhibitor+si-NC組;⑥miR-96-5p inhibitor+si-PTEN組。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測PTEN和p-Akt/Akt表達(dá)水平 用RIPA裂解液提取細(xì)胞或組織蛋白后,用 BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白加入上樣緩沖液,98 ℃變性 10 min。用10% 的SDS-PAGE膠分離,利用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5% BSA的TBST封閉液室溫孵育 1 h,加入一抗(1∶1000 稀釋于1% 牛血清白蛋白溶液中), 4 ℃過夜。次日用 緩沖液TBST洗 3 次,每次 10 min,加入二抗(1∶5000 稀釋于1% 牛血清白蛋白溶液中),室溫孵育 2 h,緩沖液TBST 洗 3 次,每次 10 min。ECL發(fā)光液發(fā)光。用Image J軟件分析條帶灰度。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胰酶消化后,重懸,接種于96孔培養(yǎng)板中,密度為每孔1×104/ml,培養(yǎng)24、48、72、96 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)前2 h加入CCK-8試劑,避光孵育,用酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm處吸光度值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胰酶消化后,重懸,稀釋至細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml,200 μl細(xì)胞懸液加入24孔板的各孔中,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用滅菌的槍頭在細(xì)胞上由上至下垂直劃線,PBS輕輕沖洗細(xì)胞1次后換入新的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。分別于處理后的0 h和48 h拍照記錄細(xì)胞遷移情況,并計(jì)算細(xì)胞遷移面積。

1.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力 經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胰酶消化后,計(jì)數(shù)1×105個(gè)/ml細(xì)胞,并用培養(yǎng)基洗滌一次,用200 μl培養(yǎng)基重懸,將細(xì)胞重懸液加入Transwell上方小室。Transwell下室加入800 μl培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)12 h。24 h后將Transwell上方小室取出,下室中已遷移的細(xì)胞用甲醇固定15 min,用0.1%的結(jié)晶紫染色。PBS洗3次,晾干后顯微鏡下觀察拍照,記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測靶基因DNA結(jié)合能力 將處理好的細(xì)胞用PBS洗滌2次。每孔加入100 μl 1×裂解液,冰上靜置20 min,離心4 ℃,20 min,12000 r/min,取上清。檢測波長425 nm處β-gal的OD值:96孔板,50 μl上清+100 μl ONPG,振蕩混勻,置于37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育15 min,用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)檢測。檢測熒光值:避光96孔板中,20 μl上清+100 μl熒光素酶底物,用多功能酶標(biāo)儀檢測。計(jì)算結(jié)果:OD425 nm熒光值。

1.8 RT-qPCR檢測miR-96-5p表達(dá)水平 不含EDTA的血樣離心后取上層血清用于檢測miR-96-5p表達(dá)水平。提取組織和細(xì)胞總RNA,測定RNA純度后,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板,采用RT-qPCR檢測各基因的表達(dá)水平。按照AceQ RT-qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒方法,采用20 μl擴(kuò)增體系,程序如下:95 ℃ 變性30 s;56 ℃ 退火30 s;72 ℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參計(jì)算基因表達(dá)量。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 抑制 miR-96-5p降低人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的遷移、侵襲和增殖 分別在人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor或NC inhibitor,提取細(xì)胞RAN,采用RT-qPCR技術(shù)檢測,miR-96-5p inhibitor組miR-96-5p的表達(dá)水平顯著低于NC inhibitor組(P<0.05,圖1A)。CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)miR-96-5p inhibitor組 72、96 h后,細(xì)胞增殖能力顯著低于NC inhibitor組(P<0.05,圖1B)。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-96-5p inhibitor組細(xì)胞的遷移侵襲能力顯著低于NC inhibitor組(P<0.01,圖1C、D)。

A:RT-qPCR技術(shù)檢測人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中 miR-96-5p的表達(dá)水平;B:CCK-8法檢測不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力;C:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;D:Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。與NC inhibitor組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 抑制miR-96-5p降低人NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖

2.2 過表達(dá)miR-96-5p促進(jìn)人NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖 分別在人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimics或NC mimics,提取細(xì)胞RAN,RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示,miR-96-5p mimics組miR-96-5p的表達(dá)水平顯著高于NC mimics組(P<0.05,圖2A)。CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)miR-96-5p mimics組在72、96 h細(xì)胞增殖能力顯著高于NC mimics組(P<0.05,圖2B)。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-96-5p mimics組細(xì)胞的遷移侵襲能力顯著高于NC mimics組(P<0.05,圖2C、D)。

A:RT-qPCR技術(shù)檢測miR-96-5p的表達(dá)水平;B:CCK-8法檢測不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力;C:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;D:Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。與NC mimics組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 過表達(dá)miR-96-5p促進(jìn)人NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖

2.3 miR-96-5p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá) 通過軟件預(yù)測顯示miR-96-5p與PTEN有互補(bǔ)的核苷酸序列。與WT-PTEN共轉(zhuǎn)染后,miR-96-5p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于NC mimics組(P<0.01);而與Mut-PTEN共轉(zhuǎn)染后,miR-96-5p mimics組與NC mimics組相比,細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05,圖3A)。表明miR-96-5p能與PTEN啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,調(diào)控PTEN的表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),miR-96-5p inhibitor組PTEN表達(dá)水平高于NC inhibitor組,miR-96-5p mimics組PTEN表達(dá)水平低于NC mimics組(P<0.05,圖3B、C)。

A:熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-96-5p與PTEN的結(jié)合情況;B、C:蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測PTEN的表達(dá)水平。與NC inhibitor組或NC mimics組比較, *P<0.05,**P<0.01圖3 miR-96-5p靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)

2.4 miR-96-5p靶向PTEN激活PI3K-Akt信號(hào)通路 在人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中轉(zhuǎn)染miR-96-5p inhibitor,抑制miR-96-5p的表達(dá),提取細(xì)胞蛋白,通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-96-5p inhibitor組Akt磷酸化水平低于NC inhibitor組。過表達(dá)miR-96-5p,發(fā)現(xiàn)miR-96-5p mimics組Akt磷酸化水平高于NC mimics組(P<0.01,圖4A、B)。沉默PTEN的表達(dá)后,miR-96-5p inhibitor組Akt磷酸化水平恢復(fù)(P<0.05,圖4C),與NC inhibitor組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示,miR-96-5p通過靶向PTEN激活PI3K-Akt信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。

A、B、C:蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組p-Akt/t-Akt的表達(dá)水平。與NC inhibitor組或NC mimics組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 miR-96-5p靶向PTEN激活PI3K-Akt信號(hào)通路

3 討 論

非編碼RNA 如miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA衍生片段(tRNA-derived fragment)在腫瘤的發(fā)生過程中起到了重要作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn),miR-34a通過抑制表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和轉(zhuǎn)化生長因子β2(Transforming growth factor β2,TGF-β2)的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌基因的作用,miR-150通過靶向p53發(fā)揮促癌基因的作用[11-12]。miRNA作為替代性腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)得到了廣泛關(guān)注,不僅可在體液中無創(chuàng)檢測,還可作為液體活檢用于早期診斷和預(yù)后[13]。在本研究中,我們重點(diǎn)研究了miR-96-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的作用及分子機(jī)制,結(jié)果表明,miR-96-5p通過抑制PTEN的表達(dá)、磷酸化激活A(yù)kt來促進(jìn)細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生。

miR-96-5已被發(fā)現(xiàn)參與結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的調(diào)控[14-16]。Ress等[14]研究發(fā)現(xiàn),體外過表達(dá)miR-96-5p通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1、增加p27-CDKN1A的表達(dá)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞生長速度,且miR-96-5p低表達(dá)是結(jié)直腸癌特異性生存的獨(dú)立預(yù)后因素。Wang等[15]采用RT-qPCR技術(shù)和Target Scan、miR Tar Base、miR DB數(shù)據(jù)庫篩選出在胃癌和癌旁正常組織中差異表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)的miRNA——miR-96-5p,并通過體外實(shí)驗(yàn)證明miR-96-5p沉默通過抑制凋亡抑制因子Bcl-2和環(huán)氧化酶COX-2的表達(dá),顯著降低人胃癌細(xì)胞MGC-803的細(xì)胞活力、增加細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和侵襲。因此,作為新興的生物標(biāo)志物,miR-96-5p能單獨(dú)或與其他miRNA聯(lián)合用于腫瘤的早期診斷及治療[17]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-96-5p與PTEN有互補(bǔ)的核苷酸序列,利用WT-PTEN和Mut-PTEN質(zhì)粒,通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-96-5p能直接與PTEN的啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合,抑制PTEN的表達(dá)。PTEN是一種雙重蛋白/脂質(zhì)磷酸酶,其主要底物是磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PIP3),PIP3的增加將Akt招募到細(xì)胞膜上并使其被磷酸化激活[18-19]。該信號(hào)通路在癌癥的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,在許多原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥中,PTEN因堿基突變、缺失或啟動(dòng)子甲基化而失活、表達(dá)降低,而PI3K-Akt的激活、突變可在多種腫瘤中出現(xiàn)[20]。PTEN/PI3K/Akt是調(diào)控細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長等多個(gè)生物學(xué)過程信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路,我們的研究結(jié)果表明,在 A549細(xì)胞中抑制miR-96-5p的表達(dá),PTEN水平升高、 Akt磷酸化水平降低,而過表達(dá)miR-96-5p后,抑制了PTEN的水平、Akt磷酸化水平升高,并且沉默PTEN的表達(dá)后,逆轉(zhuǎn)了敲低miR-96-5p對(duì)Akt磷酸化的抑制作用,提示,miR-96-5p通過靶向PTEN激活PI3K-Akt信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。

綜上所述,我們的數(shù)據(jù)表明,miR-96-5p是一個(gè)NSCLC的促進(jìn)性miRNA,在NSCLC中高表達(dá),通過抑制PTEN,激活PI3K-Akt信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖,揭示了miRNA影響NSCLC發(fā)生的潛在機(jī)制,為NSCLC診斷和治療提供了新靶點(diǎn)。但由于本研究僅限于細(xì)胞水平,miR-96-5p影響NSCLC細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。