袁浩鑫,馮一平,王思雨,曾尚云

(大同市第五人民醫(yī)院,山西 大同 037009)

宮頸癌是成年女性常見的生殖道惡性腫瘤,2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,未來10年我國宮頸癌死亡人數(shù)預(yù)計(jì)上升25%[1]。手術(shù)切除、輔助放化療是目前臨床治療宮頸癌的主要手段,但術(shù)后易復(fù)發(fā),病死率較高[2-3]。目前已知人類乳頭瘤病毒持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因,但隨著對宮頸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究,越來越多的證據(jù)表明,宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與相關(guān)基因表達(dá)水平的改變密切相關(guān),其中微小RNA(miRNA,miR)通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制靶向調(diào)控基因的表達(dá),參與宮頸癌的病理進(jìn)程[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-642a-5p是一種腫瘤抑制因子,上調(diào)miR-642a-5p表達(dá)可抑制某些惡性腫瘤如結(jié)腸癌、前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲[6-7]。且有臨床報(bào)道顯示,宮頸癌組織miR-642a-5p與人類乳頭瘤病毒陽性宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)[8]。但miR-642a-5p對于宮頸癌生物學(xué)特征的影響機(jī)制尚不清楚。本研究探究miR-642a-5p對宮頸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HeLa細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供(貨號CL-0087)。

1.2 試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、Trizol試劑、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR測定試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、MTT檢測試劑盒(貨號ml017538、ml095476、ml095837、ml078226、ml078535-R、ml095225、ml057897)購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Lipofectamine 2000試劑(貨號15596018)購自美國Invitogen公司;細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、β-actin抗體(貨號P0013、P0011、P0018M、AG2737、AN365、AF2815)購自上海碧云天生物科技有限公司;NF-κBp65抗體(貨號YT828-CQR)購自北京百奧萊博科技有限公司;miR-642a-5p mimic、miR-642a-5p mimic NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿等試驗(yàn)耗材購于杭州欣友生物技術(shù)有限公司;MG80二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購于上海冠森生物科技有限公司;Transwell小室購自美國Coring公司;Accuri C6流式細(xì)胞分析儀購于美國BD公司;Axio Observer倒置顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司;abi7500熒光定量PCR儀購于美國Abi公司;Western blot電泳儀器購于美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:在RPMI1640培養(yǎng)基中(含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素)常規(guī)接種人宮頸癌HeLa細(xì)胞,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%～90%,消化傳代后取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中,2×105個(gè)/孔,繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染miR-642a-5p mimic、miR-642a-5p mimic NC,將細(xì)胞分為對照組、miR-642a-5p mimic組、miR-642a-5p mimic NC組,各組HeLa細(xì)胞置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.2 RT-qPCR法檢測miR-642a-5p mRNA表達(dá)水平:收集各組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞,Trizol處理提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn),反應(yīng)程序:95 ℃、3 min,95 ℃、15 s,56 ℃、30 s,72 ℃、10 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,計(jì)算miR-642a-5p的表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blot法:收集各組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞,裂解提取細(xì)胞總蛋白并測定濃度。取蛋白樣品進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST漂洗10 min×3次,分別加入NF-κB p65一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶500),TBST漂洗10 min×3次,加HRP標(biāo)記的二抗(1∶200),室溫下孵育1 h,TBST洗膜10 min×3次,以ECL試劑顯影,用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描,采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3.4 MTT法:各組HeLa細(xì)胞重懸后接種于96孔培養(yǎng)板,每孔1×103～1×104個(gè)細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。嚴(yán)格按照MTT檢測試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每孔加入50 μl的MTT液(2 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)3 h,吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入DMSO液,于570 nm波長處檢測,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 Transwell法:調(diào)整各組細(xì)胞密度,Transwell小室的上室預(yù)先用Matrigel膠包被,加入細(xì)胞懸液和完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,擦去多余細(xì)胞,做好標(biāo)記,乙醇固定,PBS清洗,結(jié)晶紫染色液染色,棄掉多余染色液,加入調(diào)色液A、B,溫和混勻,PBS清洗。在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞數(shù)。在HeLa細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,將HeLa細(xì)胞接種于不鋪Matrigel膠的上室,其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù):用預(yù)冷的PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h后的各組HeLa細(xì)胞,離心重懸,調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml,加入Annexin V-FITC、PI染色液、PBS,上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中miR-642a-5p、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 miR-642a-5p mimic組miR-642a-5p mRNA表達(dá)水平高于對照組和miR-642a-5p mimic NC組,NF-κB mRNA的表達(dá)水平低于對照組和miR-642a-5p mimic NC組(均P<0.05);對照組與miR-642a-5p mimic NC組miR-642a-5p、NF-κB mRNA的表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-642a-5p、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 對照組、miR-642a-5p mimic NC組、miR-642a-5p mimic組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平分別為(0.93±0.10)、(0.91±0.13)、(0.69±0.07),三組NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);miR-642a-5p mimic組NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平低于對照組和miR-642a-5p mimic NC組(均P<0.05);對照組與miR-642a-5p mimic NC組NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同時(shí)間存活率比較 轉(zhuǎn)染0 h,對照組、miR-642a-5p mimic NC組、miR-642a-5p mimic組細(xì)胞增殖活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);轉(zhuǎn)染24、48 h,miR-642a-5p mimic組細(xì)胞增殖活性低于對照組和miR-642a-5p mimic NC組(均P<0.05);轉(zhuǎn)染24、48 h,對照組和miR-642a-5p mimic NC組細(xì)胞增殖活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);對照組、miR-642a-5p mimic NC組細(xì)胞增殖活性呈時(shí)間依賴性升高,miR-642a-5p mimic組細(xì)胞增殖活性呈時(shí)間依賴性下降(均P<0.05)。見表3。

2.4 各組HeLa細(xì)胞遷移、侵襲情況比較 對照組、miR-642a-5p mimic NC組、miR-642a-5p mimic組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、劃痕愈合率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05);miR-642a-5p mimic組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、劃痕愈合率低于對照組和miR-642a-5p mimic NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);對照組與miR-642a-5p mimic NC組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、劃痕愈合率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。見表4。

表4 各組HeLa細(xì)胞遷移、侵襲情況比較

2.5 各組Hela細(xì)胞凋亡情況比較 對照組、miR-642a-5p mimic NC組、miR-642a-5p mimic組細(xì)胞凋亡率分別為(11.20±1.63)、(12.01±1.35)、(28.04±3.62),三組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);miR-642a-5p mimic組細(xì)胞凋亡率高于對照組和miR-642a-5p mimic NC組(均P<0.05);對照組與miR-642a-5p mimic NC組細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

近年來越來越多的研究證實(shí),在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡等病理過程中均有miRNA的參與,同一種miRNA可能在不同癌癥中或不同miRNA可能在同一癌癥中發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的作用[9-11]。在眾多與腫瘤相關(guān)的miRNA中,miR-642a-5p已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[12]。如Wang等[13]研究表明,miR-642a-5p通過靶向Ⅰ型膠原α1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。郝帥等[14]研究認(rèn)為,上調(diào)miR-642a-5p表達(dá)可通過抑制核受體NF-κB信號通路,降低蛋白磷酸化水平,抑制非小細(xì)胞肺癌LTEP-a2細(xì)胞的增殖遷移能力。然而關(guān)于miR-642a-5p在宮頸癌中的作用機(jī)制研究較少。Liu等[15]報(bào)道顯示,宮頸癌細(xì)胞中miR-642a-5p表達(dá)降低。但關(guān)于miR-642a-5p對宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為影響尚不清楚。因此,本研究試探討上調(diào)miR-642a-5p表達(dá)對于HeLa細(xì)胞增殖和分化的影響。本研究結(jié)果顯示,miR-642a-5p mimic組細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、劃痕愈合率均低于對照組、miR-642a-5p mimic NC組,細(xì)胞凋亡率高于對照組、miR-642a-5p mimic NC組,提示上調(diào)miR-642a-5p表達(dá)可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的惡性進(jìn)展,但具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

NF-κB信號通路在免疫系統(tǒng)中具有重要作用,其參與細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等生理過程[16]。在正常情況下,存在于胞漿中的NF-κB復(fù)合物為非活性形式,不具備調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力,但當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌或病毒感染、炎癥細(xì)胞因子、電離輻射等外界因素刺激時(shí),NF-κB/IκB復(fù)合物解離,NF-κB信號通路被激活,進(jìn)而對相關(guān)基因發(fā)揮調(diào)控作用[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB信號通路參與人乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的病理進(jìn)程,癌細(xì)胞中不同類型的分子改變可能會激活NF-κB信號通路,使其下游基因表達(dá)異常,從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展[19-21]。目前臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)NF-κB p65在宮頸癌組織和細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高表達(dá),主要發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞凋亡和保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌HeLa細(xì)胞中,miR-642a-5p mimic組NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白的表達(dá)量均高于對照組、miR-642a-5p mimic NC組,提示過表達(dá)miR-642a-5p可能通過調(diào)控NF-κB抑制NF-κB p65蛋白表達(dá),阻斷細(xì)胞周期,誘導(dǎo)其凋亡。既往研究顯示,針對NF-κB的靶向治療可能抑制肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種癌癥的進(jìn)展[24],但在宮頸癌治療方面仍需臨床驗(yàn)證。結(jié)合本研究,未來可基于miR-642a-5p開發(fā)針對NF-κB的靶向治療藥物,為宮頸癌的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移提供新的預(yù)防治療手段。

綜上所述,上調(diào)miR-642a-5p表達(dá)可在一定程度上阻斷宮頸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展,這可能與NF-κB信號通路被抑制有關(guān)。然而,本研究僅為單一細(xì)胞系的體外研究,并未對其他宮頸癌細(xì)胞系的miR-642a-5p表達(dá)情況及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探究,后續(xù)仍需深入探索。