馬威武,劉 強(qiáng),李帥彪,蘇志恒,臧洪學(xué),邵敬會(huì)

(保定市第四中心醫(yī)院泌尿外科,河北 保定 072350)

膀胱出口梗阻(Bladder outlet obstruction,BOO)是下尿路癥狀(Lower urinary tract symptoms,LUTS)的常見病因,其可以損害膀胱形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能[1-2]。一般情況下,LUTS可以隨著阻塞的緩解而緩解,但部分患者在梗阻緩解后仍會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的膀胱功能障礙和難治性LUTS,這表明患者發(fā)生了繼發(fā)于BOO的不可逆膀胱功能障礙,嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)腎小管和間質(zhì)損傷,繼而出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化,最終損害腎功能[3]。然而,目前仍沒有有效的方法治療BOO繼發(fā)引起的膀胱功能損害。研究[4-6]表明,炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激參與BOO的病理過程,施加在膀胱上的壓力會(huì)導(dǎo)致過多促纖維化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積在膀胱壁中,損害膀胱結(jié)構(gòu)及功能,最終形成難治性膀胱功能障礙。核因子E2相關(guān)因子2 (Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激和核因子κB (NF-κB)參與的炎性反應(yīng)對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用,激活Nrf2抑制氧化應(yīng)激和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可改善膀胱功能障礙[7]。故找到改善氧化損傷和(或)抑制炎性反應(yīng)的藥物可能是治療BOO的策略之一。梔子苷(Geniposide,GE)是一種從梔子果實(shí)中提取的環(huán)烯醚萜苷,具有多種藥理活性,包括抗氧化應(yīng)激和抗炎作用[8]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)GE可以顯著逆轉(zhuǎn)部分膀胱出口梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)模型大鼠膀胱組織低順應(yīng)性和提高膀胱肌張力,激活Nrf2提高抗氧化酶水平,抑制氧化損傷引起的膀胱炎癥。本研究明確了口服GE可以改善繼發(fā)于BOO的膀胱功能障礙,并闡明了其作用機(jī)制,為后續(xù)GE臨床治療BOO提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 GE (貨號(hào)為HY-N0009)和ZD7288 (貨號(hào)為HY-101346)購(gòu)買于Med Chem Express公司;蘇木素-伊紅(HE)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)G1120、BC0025);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0059S)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0101S)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)P0018S)和蛋白印跡相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;High Capacity RNA-to-cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)4368814)和SYBRTMGreen探針(貨號(hào)4309155)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司;Nrf2和血紅素氧合酶-1 (HO-1)多克隆抗體來自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)ab92946、ab137749);核因子-κB p65 (NF-κB p65)、P-NF-κB p65 (Ser536)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(貨號(hào)8242、3033、5174、7074S)購(gòu)買于美國(guó)Cell Signaling Technology公司;其余試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)相關(guān)生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SPF級(jí)別 SD大鼠30只,體重150～170 g購(gòu)自珠海百試通生物科技有限公司,生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK(粵)2020-0051;大鼠按照廣州銳格生物科技有限公司動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng),房間溫度(22±2)oC,濕度為50%～70%,房間12 h光照/12 h黑暗交替,大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pBOO大鼠模型建立及分組[9]:大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后,沿下腹腹壁切開1～2 cm,暴露膀胱后游離出膀胱頸,緊貼膀胱頸放置PE-20管,使用3-0聚丙烯縫合線在膀胱頸和尿道周圍系上系帶,拔出PE-20管,縫合切口。術(shù)后所有大鼠均皮下注射頭孢曲松鈉(7 mg/kg)防止術(shù)后感染,按照5 mg/(kg·d)攝入量在大鼠籠內(nèi)放入含有美洛昔康的膳食補(bǔ)充劑果凍,對(duì)術(shù)后大鼠鎮(zhèn)痛。pBOO造模4周后,將大鼠分為五組,假手術(shù)(Sham)組,pBOO組,GE 20、40、80 mg/kg組,每組6只,每天灌胃1次;Sham組和pBOO組大鼠給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)給藥14 d。

1.3.2 pBOO模型大鼠膀胱尿流動(dòng)力學(xué)檢查:異氟烷麻醉大鼠,從尿道插入直徑1 mm PE-20管,按壓膀胱排凈尿液,將導(dǎo)管連接到與微量輸液泵和壓力傳感器相連的三通閥,微量輸液泵以0.2 ml/min持續(xù)向膀胱內(nèi)灌注37 ℃、0.9%氯化鈉溶液,然后利用高性能多通道信號(hào)處理器系統(tǒng)放大和可視化壓力傳感器輸出的膀胱容量及膀胱壓。膀胱容量的變化(ΔV)以灌注0.9%氯化鈉溶液到漏尿時(shí)的灌注量表示,膀胱內(nèi)壓的變化(ΔP)以漏尿點(diǎn)壓力表示,膀胱順應(yīng)性(Compliance,C)=ΔV/ΔP。

1.3.3 膀胱肌張力檢測(cè):異氟烷麻醉安樂死大鼠,無菌條件下切取大鼠膀胱,使用Krebs-Ringer營(yíng)養(yǎng)液清洗并剔除膀胱黏膜層,將膀胱切成7 mm×2 mm×2 mm大小的縱行肌條,放入含Krebs-Ringer營(yíng)養(yǎng)液的浴槽內(nèi),外圍37 ℃恒溫水浴,按照19∶1通入O2和CO2到營(yíng)養(yǎng)液中,孵育30 min后獲得膀胱肌條的基礎(chǔ)收縮力,調(diào)整基礎(chǔ)張力至0.75 g后記錄肌條收縮相對(duì)穩(wěn)定之后連續(xù)的張力,然后給予終濃度為50 μmol/L的ZD7288,記錄膀胱肌條自發(fā)性收縮幅度變化。

1.3.4 膀胱組織病理檢測(cè):石蠟包埋膀胱組織切成5 μm,按照HE試劑盒說明書進(jìn)行染色,最后利用熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照(×100)。

1.3.5 MDA含量及GSH-Px、SOD活性檢測(cè):膀胱組織稱重后,分別按照MDA、GSH-Px及SOD試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。MDA含量、GSH-Px和SOD活性結(jié)果用各組別BCA定量的蛋白質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3.6 蛋白印跡檢測(cè):蛋白定量及變性后,每孔上樣25 μg,通過SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,將膜與對(duì)應(yīng)一抗(1∶1000稀釋)在4 ℃下孵育過夜后,加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2000稀釋)室溫孵育2 h,利用Image Lab圖像采集和分析軟件進(jìn)行成像與灰度分析。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè):利用High Capacity RNA-to-cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。以18s rRNA為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt計(jì)算白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β) mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠膀胱重量及膀胱與體重比值比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠膀胱重量及膀胱與體重的比值均顯著增加(均P<0.05);GE 40、80 mg/kg組治療2周后,均可以顯著降低大鼠膀胱重量及膀胱與體重的比值(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠膀胱重量及膀胱與體重比值比較

2.2 各組大鼠膀胱順應(yīng)性和膀胱張力比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠膀胱出現(xiàn)梗阻性低順應(yīng)性和膀胱肌張力下降(均P<0.05);GE 40、80 mg/kg組治療后可以顯著提高大鼠膀胱梗阻性低順應(yīng)性和膀胱肌張力(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膀胱順應(yīng)性和膀胱張力比較

2.3 GE顯著降低pBOO模型大鼠膀胱組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn) HE染色結(jié)果顯示,pBOO大鼠膀胱組織出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),GE治療后可以明顯抑制大鼠膀胱組織中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見圖1。

2.4 各組大鼠膀胱組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠MDA含量顯著上調(diào)(P<0.05),SOD及GSH-Px活性明顯降低(均P<0.05)。GE 40、80 mg/kg組顯著降低MDA含量、增加SOD及GSH-Px活性(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠膀胱組織MDA含量、SOD和GSH-Px活性比較

2.5 各組大鼠膀胱組織Nrf2/NF-κB通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與Sham組相比,pBOO組大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著下降(均P<0.05),NF-κB蛋白磷酸化水平明顯提高(P<0.05);GE 40、80 mg/kg組顯著增加Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)、降低NF-κB蛋白磷酸化水平(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠膀胱組織Nrf2/NF-κB通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠大鼠膀胱組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較 與Sham組比較,pBOO組IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與pBOO組比較,GE 40、80 mg/kg組IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠大鼠膀胱組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

研究[10]發(fā)現(xiàn),BOO誘導(dǎo)的模型大鼠膀胱重塑與有膀胱出口梗阻的患者相似,是探索膀胱結(jié)構(gòu)和功能改變的常用模型。我們發(fā)現(xiàn)口服GE可顯著改善pBOO大鼠膀胱功能障礙。研究[11-12]表明,口服GE在不同疾病模型中的治療劑量范圍在20～200 mg/kg。急毒研究表明,GE在574 mg/kg可引起大鼠肝毒性;長(zhǎng)毒研究表明,大鼠連續(xù)口服24.3、72.9 mg/kg 90 dGE,不會(huì)引起肝毒性[13]。綜上,我們選擇的20、40、80 mg/kg劑量是安全的。

BOO可以導(dǎo)致膀胱順應(yīng)性下降,逼尿肌層中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積是順應(yīng)性降低的主要原因,由于逼尿肌對(duì)阻塞的適應(yīng),膀胱會(huì)出現(xiàn)肥大和膀胱肌彈性消失[14-15]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn),pBOO大鼠膀胱重量明顯增大,膀胱組織出現(xiàn)梗阻性低順應(yīng)性和膀胱肌張力下降?？诜礼E可提高pBOO大鼠膀胱梗阻性低順應(yīng)性和膀胱肌張力,降低膀胱重量。這提示我們GE可能通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積改善膀胱功能。

氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧會(huì)損傷膀胱組織,激活Nrf2通路可以通過促進(jìn)抗氧化基因HO-1、谷胱甘肽還原酶和SOD表達(dá)來改善膀胱功能障礙[16-17]。研究[18]發(fā)現(xiàn),Nrf2過表達(dá)通過抑制炎癥細(xì)胞募集發(fā)揮抗炎作用。因此,我們首先研究了GE在pBOO大鼠膀胱中的抗氧化活性。結(jié)果表明,GE治療后顯著逆轉(zhuǎn)了pBOO大鼠中MDA含量及GSH-Px和SOD活性;同時(shí),GE還促進(jìn)了Nrf2和HO-1蛋白表達(dá),這與預(yù)測(cè)結(jié)果和其他文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道相似。綜上,GE可能通過激活Nrf2增加pBOO大鼠的抗氧化酶活性來緩解氧化應(yīng)激。

pBOO產(chǎn)生的異常膀胱內(nèi)壓觸發(fā)了從慢性炎癥到纖維化的進(jìn)展,從而導(dǎo)致膀胱結(jié)構(gòu)和功能改變。Sezginer等[7]發(fā)現(xiàn),pBOO可以導(dǎo)致NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核,引起炎性反應(yīng)。Yucel 等[21]表明NF-κB抑制劑可以保護(hù)膀胱抵抗氧化應(yīng)激。Chen等[9]檢測(cè)了繼發(fā)于pBOO的膀胱中細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)pBOO膀胱中IL-6、IL-1β和TNF-α在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(diào)。因此,抑制NF-κB活性降低炎性因子含量可抵抗pBOO中氧化損傷。我們的結(jié)果表明,口服GE可以降低pBOO模型大鼠膀胱組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子含量。這提示我們,GE的抗炎作用也可能有助于通過長(zhǎng)期治療緩解膀胱纖維化。

綜上,口服GE在pBOO模型中顯著改善膀胱功能障礙,這可能與激活Nrf2通路,抑制pBOO大鼠膀胱組織中氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)相關(guān)。GE作為潛在的抑制膀胱炎癥和氧化應(yīng)激緩解膀胱功能障礙的候選藥物,未來還需要更多的臨床前試驗(yàn)來驗(yàn)證GE對(duì)膀胱功能障礙和膀胱纖維化的影響。