孫利娟,黃香平,張多多,張小雪,陸曉媛

(1.徐州醫(yī)科大學研究生學院,江蘇 徐州 221004;2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦科,江蘇 徐州 221004;3.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院婦科,湖北 武漢 430030)

子宮內膜異位癥是一種激素依賴性婦科疾病,表現(xiàn)為原子宮內膜細胞增殖并遷移到子宮腔以外的區(qū)域,多好發(fā)于育齡期婦女[1-2]。已有研究[3]表明,子宮內膜異位癥患者罹患其他疾病如風濕病、卵巢癌、哮喘、不孕癥等的概率更高,危害女性健康。然而,子宮內膜異位癥的確切機制尚未明確。目前研究[4]顯示,子宮內膜細胞的高增殖性和遷移性在子宮內膜異位癥的發(fā)病過程中起重要作用。微小RNA(miRNA)是一種經(jīng)典的非編碼RNA,參與自身免疫性疾病、內分泌疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。既往研究[6]證實,miRNA能夠激活或抑制多種信號通路,負責調控細胞的遷移、凋亡、增殖、上皮-間充質轉化等生物學行為。miRNA的異常表達與子宮內膜細胞的增殖和遷移之間存在相關性,恢復miRNA表達對改善子宮內膜異位癥患者的預后可能具有重要作用[7-9]。miR-6771-3p是一個長度為21個核苷酸的miRNA,其基因定位于人染色體16q12.1,是影響卵巢癌化療耐藥性的決定性因素[10]。然而,miR-6771-3p在子宮內膜異位癥中的作用機制尚不清楚。本研究探討了miR-6771-3p在子宮內膜異位組織中的表達,分析其對異位子宮內膜細胞惡性生物學行為的作用和分子機制,以期miR-6771-3p靶向治療子宮內膜異位癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 收集2020年6月至2022年9月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行“卵巢囊腫剝除術”,取得在位子宮內膜組織和異位組織34例,均經(jīng)兩名以上病理科專家診斷為子宮內膜異位癥?；颊吣挲g19～41歲,所有患者月經(jīng)規(guī)律,沒有其他生殖器官疾病,至少在5個月內沒有經(jīng)過激素類藥物治療。本研究通過本院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購自美國Gibco公司。反轉錄試劑盒和實時聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。胎牛血清、Lipofectamine 3000和引物購自美國Invitrogen公司。miR-6771-3p mimic和miR-NC mimic購自上海吉凱生物科技有限公司。靶向沉默miR-6771-3p的短發(fā)夾RNA載體和對照載體購自美國Corning公司。四噻唑藍(MTT)試劑盒和RIPA裂解液購自美國Sigma公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒、軸抑制蛋白2(AXIN2)野生型載體(AXIN2-WT)和AXIN2突變型載體(AXIN2-MUT)購自上海碧云天生物技術有限公司。一抗AXIN2、α-Tubulin、β-catenin、c-Myc、p-GSK3、Cyclin D1和山羊抗鼠二抗均購自美國BD公司。

1.3 細胞原代培養(yǎng)和轉染 將術中得到的新鮮異位子宮內膜組織采用磷酸鹽緩沖液沖洗4次,在細胞間內剪碎組織,通過膠原酶消化20 min,取上清與含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混合終止消化,離心去上清,接種到新的培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后細胞換液。當異位子宮內膜間質細胞處于對數(shù)生長期,將細胞分為空載體組和沉默組,空載體組轉染對照載體,沉默組轉染靶向沉默miR-6771-3p的短發(fā)夾RNA載體,使用Lipofectamine 3000試劑進行轉染,將狀態(tài)良好的異位子宮內膜間質細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 RT-qPCR檢測miR-6771-3p和AXIN2 mRNA表達 加入1 ml 預冷Trizol處理組織和細胞,逆轉錄為互補核糖核酸。miR-6771-3p上游引物為 5’-CTGCGGGTAGACAGGGGTTTG-3’,下游引物為5’-GACATTCACCACTGCCGTCTC-3’;GAPDH上游引物為 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’,下游引物為5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’;AXIN2上游引物為 5’-AGCCAAAGCGATCTACAAAAGG-3’,下游引物為5’-AAGTCAAAAACATCTGGTAGGCA-3’。RT-qPCR反應條件:96 ℃預變性3 min;96 ℃變性45 s;63 ℃ 36 s,71 ℃ 36 s,32個循環(huán)。以2-ΔΔCt方法計算miR-6771-3p和AXIN2 mRNA表達,以GAPDH和U6分別為內參。

1.5 MTT檢測異位子宮內膜間質細胞的增殖 將轉染后的異位子宮內膜間質細胞以6×103個/孔接種于96孔板,連續(xù)5 d在同一時間點,加入40 μl MTT試劑,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱反應5 h。去上清,加入160 μl二甲基亞砜,均勻振蕩20 min。在多功能酶標儀上測定每一個孔在450 nm波長的吸光度(OD)值。

1.6 細胞劃痕愈合實驗檢測異位子宮內膜間質細胞的遷移 將轉染后的異位子宮內膜間質細胞接種于12孔板,保證單層細胞鋪滿,去上清,采用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗板底表面4次。采用200 μl槍頭尖端在板底表面垂直劃痕,采用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗板底表面4次。加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。分別在0 h與24 h采用倒置顯微鏡照相,分別測量兩個時間點的劃痕間距,比較各組細胞的遷移率。

1.7 生物信息學技術和雙熒光素酶實驗驗證靶向關系 采用miR Sponge軟件預測miR-6771-3p具有結合位點的靶基因mRNA。收集生長到對數(shù)期異位子宮內膜間質細胞,在24孔板孵育24 h。分別將2 μl AXIN2野生型載體(AXIN2-WT)或AXIN2突變型載體(AXIN2-MUT)與miR-6771-3p mimic或miR-NC mimic共轉染異位子宮內膜間質細胞。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育46 h,采用雙熒光素酶報告基因試劑盒裂解異位子宮內膜間質細胞并分析熒光素酶的相對活性。

1.8 Western blot檢測細胞中AXIN2蛋白和Wnt信號通路蛋白的表達 加入160 μl RIPA裂解液處理轉染后的異位子宮內膜間質細胞,40 min后離心得到上清,經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,在4 ℃聚轉至聚偏氟乙烯膜。在9%脫脂牛奶中進行封閉50 min。將膜與一抗AXIN2(1∶3000稀釋)、α-Tubulin(1∶4000稀釋)、Cyclin D1(1∶3000稀釋)、β-catenin(1∶2000稀釋)、c-Myc(1∶2000稀釋)、p-GSK3(1∶1000稀釋)在5 ℃孵育過夜。與對應山羊抗鼠二抗在37 ℃孵育125 min,選擇α-Tubulin為內參,在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。

2 結 果

2.1 子宮在位內膜組織和異位內膜組織中miR-6771-3p表達比較 RT-qPCR檢測顯示,子宮在位內膜組織和異位內膜組織中miR-6771-3p表達分別為(1.15±0.13)和(4.02±0.24),子宮異位內膜組織中miR-6771-3p的表達高于子宮在位內膜組織(P<0.01)。

2.2 短發(fā)夾RNA轉染對miR-6771-3p表達水平的影響 RT-qPCR檢測顯示,沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞中miR-6771-3p分別為(0.97±0.39)和(4.51±1.64),沉默組明顯低于空載體組(P<0.01)。

2.3 沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞增殖情況比較 通過MTT法分析顯示(圖1),在第2、3、4、5天,沉默miR-6771-3p的沉默組異位子宮內膜間質細胞活力低于空載體組(均P<0.05)。

注:與空載體組相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞增殖情況比較

2.4 沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞遷移情況比較 通過細胞劃痕愈合實驗分析顯示,沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞遷移率分別為(16.36±4.38)%和(55.38±7.12)%,沉默組異位子宮內膜間質細胞遷移率明顯低于空載體組(P<0.01)。

2.5 生物信息學軟件預測miR-6771-3p的靶基因 采用miR Sponge軟件預測顯示(圖2),miR-6771-3p與AXIN2 mRNA具有結合位點,AXIN2野生型載體位點(GGGUUU)突變?yōu)锳XIN2突變型載體(CCCAAA)。

圖2 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的結合位點

2.6 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的相互關系 雙熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)(圖3),與AXIN2-WT+miR-NC mimic共轉染相比,AXIN2-WT+miR-6771-3p mimic明顯降低了異位子宮內膜間質細胞的熒光素酶相對活性(P<0.01)。

注:與miR-NC比較,**P<0.01圖3 miR-6771-3p與AXIN2 mRNA的相互關系

2.7 沉默miR-6771-3p對異位子宮內膜間質細胞中AXIN2 mRNA表達的影響 RT-qPCR檢測顯示,沉默組和空載體組異位子宮內膜間質細胞中AXIN2 mRNA表達分別為(7.87±1.26)和(1.01±0.42),沉默組AXIN2 mRNA表達顯著高于空載體組(P<0.01)。

2.8 沉默miR-6771-3p對AXIN2蛋白和Wnt信號通路蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示(圖4),與空載體組相比,沉默miR-6771-3p后AXIN2蛋白表達顯著增加(P<0.01),細胞Wnt信號通路蛋白β-catenin、c-Myc、p-GSK3、Cyclin D1表達明顯降低(均P<0.01)。

注:與空載體組比較,**P<0.01圖4 沉默miR-6771-3p對AXIN2蛋白和Wnt信號通路蛋白表達的影響

3 討 論

子宮內膜異位癥是常見的婦科疾病之一,一般采用手術和激素治療,患者復發(fā)的風險很高[11-13]。因此,尋找潛在的分子治療靶點可能有助于改善子宮內膜異位癥的預后。最近研究[14-16]表明,miRNA參與子宮內膜細胞的增殖和遷移過程,可以作為子宮內膜異位癥的診斷標志物和治療靶點。例如,在位子宮內膜組織中miR-126表達高于異位子宮內膜組織,miR-126可通過有效抑制異位子宮內膜間質細胞遷移和侵襲,減緩子宮內膜異位癥的發(fā)展[17]。又如,miR-141-5p在異位子宮內膜組織中的表達水平顯著低于在位子宮內膜組織,其通過抑制異位子宮內膜間質細胞的上皮-間充質轉化和增殖,降低子宮內膜異位癥的病灶大小[18]。既往研究[10]發(fā)現(xiàn),miR-6771-3p在卵巢癌組織和細胞系中低表達,參與調控卵巢癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性。然而,miR-6771-3p在子宮內膜異位癥中的作用和生物學機制尚未被報道研究。

本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),在34例子宮異位內膜組織中miR-6771-3p表達明顯高于在位內膜組織,這表明miR-6771-3p可能是子宮內膜異位癥的促進因子。為進一步確定其在子宮內膜異位癥中的功能,本研究通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),沉默miR-6771-3p可明顯抑制異位子宮內膜間質細胞的增殖和遷移,這說明靶向沉默miR-6771-3p對子宮內膜異位癥的發(fā)病可能具有改善功能。miRNA主要通過靶向結合靶基因3’非翻譯區(qū),特異性降低靶基因的表達,調控細胞的生物學行為[19-21]。本研究通過靶基因預測技術和雙熒光素酶報告基因分析證實,miR-6771-3p靶向結合AXIN2 mRNA。AXIN2蛋白是經(jīng)典分子通路Wnt信號通路的關鍵調控因子,其在細胞的分化、發(fā)育、遷移和增殖等生物學行為中發(fā)揮重要作用[22]。研究[23]表明,AXIN2蛋白能夠有效抑制細胞的生長和轉移,淋巴結轉移的腫瘤組織中AXIN2蛋白表達明顯小于無淋巴結轉移。AXIN2蛋白通過磷酸化β-catenin蛋白,加速其被泛蛋白酶降解,有效抑制β-catenin蛋白的表達,從而干擾Wnt信號通路的轉導[24]。因此,AXIN2蛋白能夠通過干擾Wnt信號通路,抑制子宮內膜異位癥的發(fā)生。在本研究中,沉默miR-6771-3p表達,降低了異位子宮內膜間質細胞中AXIN2基因水平,阻滯Wnt信號通路轉導。

綜上所述,miR-6771-3p在子宮異位內膜組織中高表達,沉默miR-6771-3p可以靶向上調AXIN2基因表達并且降低Wnt信號通路活性,抑制異位子宮內膜間質細胞的增殖和遷移。miR-6771-3p可能是子宮內膜異位癥治療的分子標志物和潛在治療靶點。