張 晶,賈翠楠,何 冰,李彬琦,鞏蘭平

(邯鄲市中心醫(yī)院口腔科,河北 邯鄲 056000)

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病,其主要特征為牙齦炎癥、牙槽骨吸收、牙周組織退化等,是常見的口腔疾病[1-2]。牙周炎隨著年齡增長其發(fā)病率持續(xù)升高,隨著我國人口老齡化的加劇,牙周炎嚴(yán)重威脅著人們的口腔健康[3]。如何利用藥物鞏固經(jīng)典治療手段的治療效果是目前口腔醫(yī)生面對(duì)的主要問題。金絲桃苷是一種黃銅醇苷類化合物,在金絲桃科、桔梗科、薔薇科等多種植物中廣泛存在,其具有多種生物活性,包括抗炎、抗氧化和心肌保護(hù)作用,在多種疾病中發(fā)揮重要作用[4]。已有研究[5]報(bào)道,金絲桃苷具有促進(jìn)大鼠成骨分化、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用,對(duì)牙周炎具有潛在治療特性。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,金絲桃苷可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路來減輕復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠炎性反應(yīng)[6]。但金絲桃苷是否可通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路治療牙周炎尚未可知。因此,本研究基于TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路探究金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠,10周齡,體重341～369 g,購自上海博湖生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2020-0014,大鼠在室溫22～27 ℃,濕度52%～62%,晝/夜各12 h循環(huán)照明的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水、攝食。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。金絲桃苷(批號(hào)NJ528-44,原料藥,純度≥99.83%,與0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為3 mg/ml的混懸液)購自嘉興南箭生物材料有限公司;脂多糖(批號(hào)HX28504,與0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為0.04 mg/ml的混懸液)、標(biāo)準(zhǔn)菌混合懸液(批號(hào)HX25119)、HE染色試劑盒(批號(hào)HX25115)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(批號(hào)HX41159)、蛋白裂解液(批號(hào)HX44106)、ECL試劑(批號(hào)HX59259)均購自蘇州泓迅生物科技有限公司;大鼠骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG)(批號(hào)DH20400)、NF-κB受體活化因子配體(RANKL)(批號(hào)DH42815)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號(hào)DH58185)、白介素-6(IL-6)(批號(hào)DH69004)ELISA試劑盒均購自廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑(批號(hào)ZJ41955)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)ZJ58295)、PCR試劑盒(批號(hào)ZJ68194)、BCA試劑盒(批號(hào)ZJ40220)均購自福州載基生物科技有限公司;兔源TLR4(批號(hào)RN42611)、MyD88(批號(hào)RN69192)、NF-κB(批號(hào)RN53150)、GAPDH(批號(hào)RN44359)一抗、羊抗兔二抗(批號(hào)RN67392)均購自杭州然鈉生物科技有限公司。顯微鏡(型號(hào)BM1650A)、酶標(biāo)儀(型號(hào)Infinite 200 Pro)、熒光定量PCR儀(型號(hào)Quant Studio 3)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Quick Gel 6200)均購自江蘇楚天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型的構(gòu)建及分組給藥:構(gòu)建牙周炎大鼠模型[7],麻醉大鼠,選用0.2 mm的正畸鋼絲在第1、2磨牙間隙中穿過,結(jié)扎雙側(cè)上頜1、2磨牙牙頸部,將結(jié)扎線深埋入大鼠牙齦溝,同時(shí)于牙齦溝接種濃度為109CFU/ml的4種標(biāo)準(zhǔn)菌混合液。結(jié)扎1周后檢查鋼絲是否牢固,8周后若大鼠牙周可見牙齦紅腫、探診易出血,有深牙周袋形成則表明牙周炎大鼠造模成功。將45只建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、金絲桃苷(30 mg/kg)組[8]、金絲桃苷(30 mg/kg)+TLR4激活劑(脂多糖,0.4 mg/kg)組[9],每組15只,另取15只健康大鼠作為對(duì)照組。建模結(jié)束后,金絲桃苷組大鼠腹腔注射30 mg/kg的金絲桃苷[8];金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠于腹腔分別注射30 mg/kg金絲桃苷和0.4 mg/kg脂多糖[9];對(duì)照組、模型組大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液,各組給藥每天1次,連續(xù)4周。

1.2.2 標(biāo)本采集:末次給藥結(jié)束24 h后,麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,4 ℃下4400 r/min離心16 min,取上清,置于-80 ℃冰箱中保存,隨即斷頭處死大鼠,分離牙周組織,取部分牙周組織置于-80 ℃冰箱中保存,剩余牙周組織固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠牙周組織病理學(xué)變化:取固定于4%多聚甲醛中的大鼠牙周組織,石蠟包埋,切片(4 μm),取部分切片,HE染色,每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)視野,光鏡下觀察。

1.2.4 TRAP染色檢測大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量:取其余切片,TRAP固定液固定60 s,使用TRAP染色試劑盒染色,脫水封片后,每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)視野,在光鏡下計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)量(破骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染為紅色,細(xì)胞核被染為藍(lán)色),取平均值。

1.2.5 ELISA法檢測各組大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達(dá)水平:取凍存大鼠血清,低溫融化,按照OPG、RANKL、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說明書,檢測大鼠血清中OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

1.2.6 熒光定量PCR法檢測各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平:取凍存大鼠牙周組織,加入液氮研磨,Trizol試劑提取大鼠牙周組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR法檢測大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平,以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系為:cDNA 2 μl、緩沖液5 μl、dNTPs 4 μl、正反向引物各1 μl、DNA聚合酶1 μl、ddH2O 16 μl。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 60 s),72 ℃延伸10 min。引物由鄭州樂睿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成,引物序列見表1。被測mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法采用基因定量方法(2-ΔΔCt法)。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印跡法檢測各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平:取大鼠凍存牙周組織,研磨,加入蛋白裂解液提裂解,BCA法定量總蛋白,電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,然后將膜與稀釋好的兔源TLR4(1∶1500)、MyD88(1∶1200)、NF-κB(1∶1100)、GAPDH(1∶1900)一抗在4 ℃下孵育過夜,然后將膜暴露于稀釋好的羊抗兔二抗(1∶2100)中,室溫孵育2 h,加入ECL試劑檢測蛋白質(zhì)印跡,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織病理學(xué)變化的影響 對(duì)照組大鼠牙周組織結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠牙周組織炎性細(xì)胞浸潤明顯,伴隨骨吸收陷窩數(shù)量增多;與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙齦上皮較完整,炎性細(xì)胞浸潤程度較輕,骨吸收陷窩減少;與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織炎性細(xì)胞浸潤程度加深,骨吸收陷窩增多。見圖1。

2.2 金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè))

2.3 金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清OPG水平顯著降低(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠血清OPG水平顯著升高(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著降低(均P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠血清OPG水平顯著降低(均P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

2.4 金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

2.5 金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷組相比,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

牙周炎能致使人牙齒缺失,是一種破壞性疾病,其不僅對(duì)人們的口腔健康有嚴(yán)重危害,也與全身系統(tǒng)疾病的發(fā)生緊密相關(guān),例如心臟病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等[10-11]。盡管近年來對(duì)牙周炎的研究進(jìn)展較快,但其發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升的趨勢[12],因此,深入探究牙周炎的發(fā)病機(jī)制,尋找治療牙周炎有效的方法、藥物具有重要意義。本研究通過結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜1、2磨牙牙頸部建立牙周炎大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙槽骨吸收,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)大量骨吸收陷窩,TNF-α、IL-6水平升高,與陳晨等[7]研究結(jié)果類似,說明牙周炎大鼠建模成功。牙槽骨吸收是牙周炎的一種臨床表現(xiàn),當(dāng)牙槽骨骨形成速度低于骨吸收速度,牙周炎患者的牙齒將會(huì)松動(dòng),這也是導(dǎo)致牙齒缺失的主要原因之一[13-14]。OPG能抑制破骨細(xì)胞形成及骨吸收,這與RANKL的作用相反,OPG水平升高、RANKL水平降低即表明牙槽骨吸收被阻斷,牙周組織損傷得到抑制[15]。本研究發(fā)現(xiàn),同健康大鼠比,牙周炎大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量、血清RANKL水平升高,血清OPG水平降低,提示牙周炎大鼠牙周組織牙槽骨吸收加速,牙周組織發(fā)生損傷。

金絲桃苷是一種廣泛存在于各種植物內(nèi)的天然黃酮類化合物,已有文獻(xiàn)報(bào)道,金絲桃苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡具有抑制作用[16],其也能夠提高IL-1β誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性,抑制炎性因子和細(xì)胞外基質(zhì)紊亂[17]。本研究發(fā)現(xiàn),使用金絲桃苷處理牙周炎大鼠后,大鼠牙周組織病變減輕,牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著降低,血清OPG水平顯著升高,與Xu等[5]研究結(jié)果一致,說明金絲桃苷可能通過減少破骨細(xì)胞的形成和牙槽骨吸收,抑制炎性反應(yīng),來改善牙周炎大鼠的牙周組織損傷。

TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在多種細(xì)胞中廣泛存在,是炎性反應(yīng)關(guān)鍵通路,抑制該通路可阻斷多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[18-19]。相關(guān)研究表明,阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路活化可減輕牙周膜細(xì)胞炎癥[20];本研究發(fā)現(xiàn),與健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平明顯升高,提示TLR4/MyD88/NF-κB通路可能參與了牙周炎大鼠牙周組織損傷,該通路可能處于激活狀態(tài),其促進(jìn)了牙周組織的骨吸收、抑制骨形成。與模型組相比,金絲桃苷組大鼠牙周組織中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平顯著降低,推測金絲桃苷可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕牙周炎大鼠的牙周組織損傷。為了驗(yàn)證該推測,本研究利用TLR4激活劑脂多糖進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與金絲桃苷組比較,金絲桃苷+TLR4激活劑組大鼠牙周組織損傷以及骨吸收加重,牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平顯著升高,OPG水平顯著降低,說明TLR4激活劑可部分逆轉(zhuǎn)金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠的改善效果,進(jìn)一步表明金絲桃苷可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,調(diào)控炎癥以及骨吸收相關(guān)因子表達(dá),促進(jìn)牙槽骨修復(fù),改善牙周炎大鼠牙周組織損傷。

綜上所述,金絲桃苷可緩解牙周炎大鼠牙周組織損傷,抑制大鼠炎性反應(yīng)和牙槽骨吸收,其機(jī)制與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。但本研究未對(duì)牙周炎大鼠的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測與分析,且未對(duì)通路的上下游調(diào)控因子進(jìn)行更深入的探究,不能確定金絲桃苷對(duì)牙周炎大鼠牙周組織損傷的改善作用是否與氧化應(yīng)激以及通路上下游調(diào)控有關(guān),對(duì)此,后續(xù)將針對(duì)不足之處進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以完善金絲桃苷對(duì)牙周組織損傷的機(jī)制研究。