黨旭升,趙永林,丁 朵,潘龍飛

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 710004)

腦外傷(Traumatic brain injury,TBI)是各種外力因素導(dǎo)致顱腦的損傷,在全球范圍內(nèi)發(fā)生率高,中度至重度TBI患者可能會長期存在后遺癥,給家庭和社會帶來沉重負擔?，F(xiàn)在研究認為TBI的病理生理過程分為兩個時期,第一為外傷瞬間發(fā)生的原發(fā)性損害;第二為繼發(fā)性損傷,主要因為TBI后腦血流減少,進而導(dǎo)致腦缺血和缺氧,最終引起神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞的損傷[1]。盡管有報道一些方法可以改善腦外傷的預(yù)后及后遺癥,但仍缺少有效的藥物治療或減輕TBI后的腦損傷[2-3]。芹菜素是一種有廣泛生物學活性的黃酮化合物,具有無誘變性和低毒性的特點,主要分布于蔬菜和水果中,且芹菜中含量最高。芹菜素已被證實具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、擴張血管等多種藥理作用[4-5]。研究[6]表明,芹菜素可能通過增加白細胞介素10的水平,對輕度TBI具有神經(jīng)保護作用。但芹菜素對TBI的保護作用及潛在機制仍需要進一步探討。本研究擬探討芹菜素對大鼠腦外傷后膠質(zhì)細胞活化、血腦屏障通透性、炎性因子及氧化應(yīng)激水平的影響,并探索其潛在的分子機制,為芹菜素治療腦外傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物分組:72只清潔級雄性SD大鼠,從西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心購買,8～10周齡,體重250～300 g。大鼠飼養(yǎng)在溫度(23±1)℃的環(huán)境中,食水自由,每天12 h照明及12 h黑暗。根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、TBI組、TBI+芹菜素組,每組24只,其中6只用于形態(tài)學檢測,6只用于腦組織含水量檢測,6只用于伊文斯藍檢測,6只用于Western blot、氧化應(yīng)激、炎性因子檢測。TBI+芹菜素組大鼠造模后每天腹腔注射芹菜素(40 mg/kg),持續(xù)3 d[6]。

1.1.2 主要試劑與儀器:芹菜素購自美國Sigma-Aldrich公司;神經(jīng)微絲中鏈蛋白(NF-M)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;離子鈣接頭蛋白抗體(Iba-1)抗體購自日本W(wǎng)ako公司;Claudin-5、ZO-1、Occludin-1、β-actin抗體購自Abcam公司;免疫組化SP試劑盒、DAB顯色盒購自北京中杉金橋公司;Western blot相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-6 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司;超氧化物歧化酶(SOD)比色活性試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒、脂質(zhì)過氧化(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自美國Merck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備:大鼠TBI模型采用 Feeney 法,利用自由落體打擊裝置導(dǎo)致顱腦損傷[7]。戊巴比妥鈉麻醉大鼠,俯臥位,利用腦立體定向儀固定,切開顱骨表面皮膚,暴露顱骨,利用磨鉆開一骨窗,位置為前囟后1.5 mm、右旁開2.5 mm,暴露硬腦膜,直徑5 mm,將20 g打擊錘置于硬腦膜正上方,打擊錘于15 cm高度沿導(dǎo)管墜落,造模后骨蠟封閉骨窗,縫合皮膚。對照組僅麻醉、去骨瓣。

1.2.2 HE染色:處死大鼠后,灌注0.9%氯化鈉溶液及多聚甲醛后取腦,常規(guī)包埋、切片。二甲苯透明,梯度乙醇脫去二甲苯,蒸餾水漂洗,蘇木精染色15 min,伊紅染色3 min,梯度乙醇脫水,常規(guī)封片,光學顯微鏡觀察,圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3 伊文斯藍:通過測量伊文斯藍外滲的量來評估腦外傷后微血管通透性的改變。經(jīng)股靜脈注射伊文斯藍(0.2 ml/100 g),2 h后處死大鼠,0.9%氯化鈉溶液灌注后取腦,并將大腦分成兩個半球。每個樣品立即稱重,用10%的三氯乙酸溶液勻漿,離心20 min。將上清與乙醇混合,用分光光度計在波長610 nm處測量。

1.2.4 腦組織含水量檢測:采用干濕重法測定腦組織含水量。將新鮮腦標本分成兩個半球,分別測量濕重。繼續(xù)將大腦半球放入100 ℃的烤箱中72 h,再次稱重(干重)。腦組織含水量(%)計算公式為[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.2.5 Western blot檢測微管相關(guān)蛋白表達:大鼠麻醉后處死,冰上分離腦組織,RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑處理,離心后收集上清。用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度,蛋白煮沸后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,繼續(xù)轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶在室溫下封閉。4 ℃一抗孵育過夜:Claudin-5(1∶1000)、ZO-1(1∶1000)、Occludin-1(1∶1000)、β-actin(1∶1000)。繼續(xù)用辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗孵育?；瘜W發(fā)光法顯色、拍照,然后使用Image J軟件進行分析。

1.2.6 免疫組化檢測Iba-1、GFAP及NF-M的表達:大鼠處死后灌注、取腦,常規(guī)石蠟包埋、切片。將切片在檸檬酸緩沖液中提取抗原。洗滌后用H2O2孵育10 min,牛血清白蛋白在室溫下封閉1 h,加入一抗:Iba-1抗體(1∶400)、GFAP抗體(1∶200)、NF-M抗體(1∶200),4 ℃過夜,清洗后,二抗在室溫下孵育30 min。辣根酶標記鏈霉卵白素孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復(fù)染,脫水、封片,每張切片隨機選取6個視野,采集圖像。結(jié)果以免疫組化評分進行評估,染色強度與陽性細胞數(shù)的乘積為免疫組化評分,其中染色強度評分包括:無染色、輕度染色、中度染色、重度染色,分別為:0分、1分、 2分、3分;陽性細胞數(shù)百分比評分包括:無染色、1%～10%染色、11%～50%染色、51%～80%染色、81%～100%染色,分別為0分、1分、2分、3分、4分。評分最高12分,最低0分[8]。

1.2.7 ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達:取-80 ℃保存的大鼠腦組織,溶解、離心后取上清,采用ELISA試劑盒按照說明書步驟檢測上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達水平。具體為:包被液稀釋包被抗原,洗滌后加封閉液,再次洗滌后結(jié)合一抗,洗滌后結(jié)合酶標二抗,顯色后加入終止液,使用酶標儀讀取450 nm的OD值。

1.2.8 氧化應(yīng)激水平檢測:大鼠皮層用9倍體積的0.9%氯化鈉溶液進行勻漿,4 ℃下離心15 min。用試劑盒檢測 SOD、CAT、GSH-Px 及 MDA 的含量。

2 結(jié) 果

2.1 芹菜素對TBI后神經(jīng)損傷的影響 HE染色提示:對照組大鼠皮層腦組織鏡下可見神經(jīng)細胞排列整齊、胞膜結(jié)構(gòu)完整、染色質(zhì)清晰。TBI組均可見不同程度的神經(jīng)纖維排列紊亂、結(jié)構(gòu)扭曲、神經(jīng)細胞胞體腫脹、胞核固縮。與TBI+芹菜素組相比,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)扭曲、胞體腫脹等病理改變明顯減輕(圖1)。免疫組化染色提示:對照組內(nèi)NF-M表達量少,與對照組相比,TBI組NF-M的表達明顯升高;與TBI組相比,TBI+芹菜素組NF-M的表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。提示芹菜素可以減輕TBI后的神經(jīng)損傷。

圖1 芹菜素對TBI后神經(jīng)損傷的影響(HE染色,×20)

注:與對照組相比,*P<0.05;與TBI組相比,#P<0.05圖2 芹菜素減輕TBI后的神經(jīng)損傷(免疫組化染色,×20)

2.2 芹菜素對TBI后血腦屏障通透性的影響 Western blot結(jié)果提示:與對照組相比,TBI組Claudin-5、ZO-1、Occludin-1的表達均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),提示TBI后血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)被破壞;與TBI組相比,TBI+芹菜素組Claudin-5、ZO-1、Occludin-1的表達均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖3A)。與對照組相比,TBI組皮層腦組織含水量及伊文斯藍含量均明顯升高(均P<0.05);與TBI組相比,TBI+芹菜素組腦組織含水量及伊文斯藍含量均下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖3B)。提示芹菜素可以減輕TBI后的BBB破壞。

2.3 芹菜素對TBI后的膠質(zhì)反應(yīng)的影響 免疫組化結(jié)果提示:對照組內(nèi)GFAP及Iba-1的表達均較少。與對照組相比,TBI組GFAP、Iba-1的表達均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),提示TBI后受損皮層內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞大量活化;與TBI組相比,TBI+芹菜素組GFAP、Iba-1的表達均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖4、5)。提示芹菜素可以抑制TBI后的膠質(zhì)細胞反應(yīng)。

注:與對照組相比,*P<0.05;與TBI組相比,#P<0.05圖4 芹菜素對TBI后星形膠質(zhì)細胞活化的影響(免疫組化染色,×20)

注:與對照組相比,*P<0.05;與TBI組相比,#P<0.05圖5 芹菜素對TBI后小膠質(zhì)細胞活化的影響(免疫組化染色,×20)

2.4 芹菜素對TBI后大鼠腦皮層組織炎性反應(yīng)及降低氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組相比,TBI組大鼠皮層組織中SOD、GSH-Px和CAT活性降低,MDA含量升高(均P<0.05)。與TBI組比較,TBI+芹菜素組大鼠腦皮層組織中 SOD、GSH-Px 和 CAT 活性增強,MDA 含量減少(均P<0.05)(圖6A)。與對照組相比,TBI組促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平均明顯升高(均P<0.05),與TBI組相比,TBI+芹菜素組IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平明顯降低(均P<0.05)(圖6B);提示芹菜素可以降低TBI后炎性因子和氧化應(yīng)激水平。

注:與對照組相比,*P<0.05;與TBI組相比,#P<0.05圖6 芹菜素對TBI后大鼠腦皮層組織炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平的影響

3 討 論

本研究中HE染色及NF-M的免疫組化染色發(fā)現(xiàn),TBI組大鼠腦皮層神經(jīng)細胞腫脹、壞死、神經(jīng)纖維扭曲,軸索損傷標志物NF-M的表達升高,故本研究采用自由落體致傷法成功模擬臨床TBI。TBI的致死率和致殘率高,近年來開展了多項針對TBI患者的各種干預(yù)措施的隨機對照試驗,但均未取得令人滿意的結(jié)果,因此迫切需要更有效的藥物來治療TBI[9]。

芹菜素是天然抗氧化劑,有降血壓和舒張血管、預(yù)防動脈粥樣硬化、抑制腫瘤等作用,對糖尿病、健忘癥和阿爾茨海默病、抑郁癥和失眠等也有一定的緩解作用[4,10-12]。研究[13-15]發(fā)現(xiàn),芹菜素可以通過下調(diào)氧化應(yīng)激和炎癥來改善糖尿病大鼠的糖脂代謝和內(nèi)皮功能障礙;也可以劑量依賴性地降低阿爾茨海默動物模型的氧化應(yīng)激水平,抑制乙酰膽堿酯酶的活性及Aβ-42聚集體的形成;并能通過調(diào)節(jié)AMPK通路緩解抑郁癥動物的行為障礙,恢復(fù)細胞抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)TBI 后連續(xù) 3 d 給予芹菜素,可減輕TBI后的神經(jīng)損傷,保護BBB完整性,并抑制膠質(zhì)細胞的活化,提示芹菜素可以減輕TBI后的腦損傷。

BBB是內(nèi)皮細胞的高度選擇性半透性邊界,可防止循環(huán)血液中的溶質(zhì)非選擇性地進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。BBB被破壞是TBI后的關(guān)鍵繼發(fā)性損傷事件,導(dǎo)致通透性增加,血管源性腦水腫,顱內(nèi)壓增高等,最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[16]。TBI后炎性反應(yīng)是BBB被破壞的機制之一。炎性反應(yīng)有助于清除壞死組織碎片,促進膠質(zhì)細胞分化及血管生成,有效修復(fù)神經(jīng)組織,但過度且持續(xù)的神經(jīng)炎性反應(yīng)可增加BBB通透性,加快腦水腫發(fā)生[17]。本研究中,TBI后緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin-1的表達降低,伴有腦組織含水量及伊文斯藍滲透量增加,提示BBB被破壞,而芹菜素則可以減輕BBB的破壞。

芹菜素對TBI后BBB的保護作用可能與抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),芹菜素對化療藥物誘導(dǎo)的腎毒性具有保護作用,其保護作用與降低MDA、IL-6、TNF-α、caspase-1、IL-1β 的水平、升高 SOD 活性及GSH 水平有關(guān)[18]。用芹菜素處理小鼠的膽汁淤積模型,可以減輕膽囊萎縮及相關(guān)的肝損傷,緩解膽汁酸代謝異常,其保護作用與抑制TLR4/NF-κB通路及降低下游炎癥因子及氧化應(yīng)激水平有關(guān)[19]。既往還發(fā)現(xiàn)芹菜素可以增加TBI后腦內(nèi)抗炎因子IL-10的水平,對輕度TBI具有神經(jīng)保護作用[6]。本研究中,芹菜素能降低促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平及氧化應(yīng)激水平,與既往研究結(jié)果一致。小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞,當它們被激活時,分泌多種細胞因子和炎性介質(zhì)來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥,導(dǎo)致神經(jīng)毒性[20]。本研究中TBI 后星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞過度激活,而芹菜素能抑制膠質(zhì)細胞活性,這可能是芹菜素抑制炎癥及氧化應(yīng)激的機制之一。

綜上所述,芹菜素對大鼠TBI具有保護作用。芹菜素通過抑制膠質(zhì)細胞活性,降低體內(nèi)的炎癥及氧化應(yīng)激水平,減輕BBB的破壞,保護神經(jīng)細胞,這可能是芹菜素改善TBI的作用機制。