李偉華,安書杰,孟 華,沙南希,王雙勇

(1.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院綜合診療科,陜西 西安 710032;2.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院眼科,廣東 廣州 510150)

糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者最常見的眼部并發(fā)癥之一,主要是由于高血糖導致視網膜血管異常和新生血管形成,從而引起視網膜水腫、出血、視網膜缺血等病變[1-2]。人視網膜血管內皮細胞在糖尿病視網膜病變中發(fā)揮了重要的作用[3]。人視網膜血管內皮細胞是視網膜血管的內層細胞,維持著視網膜血管壁的完整性和正常功能。在高血糖條件下,人視網膜血管內皮細胞受到損傷,導致血管內皮細胞功能障礙和血管通透性增加,從而加速了DR的發(fā)展[4-5]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類環(huán)形RNA分子,具有穩(wěn)定性和廣泛的表達特點[6]。最近的研究[7]表明,circRNA在DR的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。研究[8-9]發(fā)現circRNA參與了視網膜神經元凋亡、視網膜神經膠質細胞激活、視網膜毛細血管損傷等過程。研究[10]顯示circFAM73A在DR中顯著高表達,然而其具體作用和調控機制尚未完全明確。因此,本研究主要探討circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的影響,及對circFAM73A/miR-140-3p軸的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(美國Life Technologies Corporation公司),Trizol試劑(美國生命技術公司),RNA反轉錄試劑盒(日本Takara公司),Lipofectamine 3000和Protein A磁珠(美國Invitrogen公司),Transwell小室(Chemicon公司),HRP標記的羊抗兔IgG抗體(美國CST公司),RIP RNA試劑盒(美國Millipore公司),細胞凋亡試劑盒(中國上海弗元生物科技有限公司),Dual Luciferase Reporter Assay試劑盒(美國Promega公司),兔抗人TNF-α、IL-6和Cleaved caspase 3抗體(美國Sigma-Aldrich公司)。引物由中國上海生工合成,質粒由中國上海吉凱基因公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染:人視網膜血管內皮細胞購自美國ATCC細胞庫,采用含有10% FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)。當細胞密度達到70%～80%時,進行下一步實驗。細胞分為正常葡萄糖(NG)組和高葡萄糖(HG)組,葡萄糖干預濃度分為5.5 mmol/L和25 mmol/L。細胞轉染采用Lipofectamine 3000,將100 nmol/L的circFAM73A小干擾RNA(si-circFAM73A)、miR-140-3p inhibitors及相應陰性對照轉染至細胞中。轉染48 h后,進行后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):采用Trizol試劑提取人視網膜血管內皮細胞RNA樣本,使用RNA反轉錄試劑盒對circRNA和mRNA進行逆轉錄,使用miRNA反轉錄試劑盒對miRNA進行逆轉錄。qPCR反應使用實時熒光定量PCR試劑盒(適用于circRNA和mRNA)和miRNA熒光定量PCR試劑盒(適用于miRNA)進行。以GAPDH(circRNA和mRNA)或U6(miRNA)作為內參并通過2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測:將野生型(WT)和突變型(MUT)3’-UTR circFAM73A的雙熒光素酶報告基因質粒與miR-140-3p mimic/nc mimic同時轉染入人視網膜血管內皮細胞中,并孵育48 h。隨后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性,并以Renilla熒光素酶活性作為內參測量熒光素酶活性。

2014年5月30日，由中國水利學會聯(lián)合禹城大禹文化研究會、國際生態(tài)安全合作組織、全聯(lián)環(huán)境服務業(yè)商會、水利部科技推廣中心共同主辦的“中國（國際）水務高峰論壇——2014中國·禹城水生態(tài)文明建設論壇”在山東禹城開幕。此次論壇主題為“水生態(tài)文明建設與縣域經濟”，來自全國相關政府部門、權威機構、學術單位的專家學者以及企業(yè)代表300余人齊聚一堂，共謀水生態(tài)文明建設之道。

1.2.4 遷移實驗:細胞被用預冷PBS洗滌兩次,然后在無血清的DMEM中稀釋到1×104/ml的細胞懸液。接下來,將Transwell小室插入24孔板中,基底腔包含含有10% FBS的培養(yǎng)基,而上面腔則包含細胞懸液。培養(yǎng)48 h后遷移的細胞被100%甲醇固定30 min,然后用0.1%結晶紫染色,倒置顯微鏡下觀察每個孔的五個隨機視野中遷移的細胞數。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析。本研究的所有數據均以平均值±標準差表示,實驗至少重復進行了3次,使用Student’st檢驗或單因素方差分析(ANOVA)進行組間比較,使用Tukey的事后檢驗進行多重比較;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:細胞轉染后采用PBS洗滌2次,在暗室中同時用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色15 min。使用FC-500流式細胞儀識別FITC+和PI+/-的凋亡細胞,并計算各組細胞凋亡率。

circRNA能夠通過多種途徑調節(jié)人視網膜血管內皮細胞功能和DR的發(fā)展[11]。最常見的調控方式為circRNA作為miRNA的“海綿”吸附miRNA,從而影響miRNA的功能;另外部分circRNA則可以與RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)相互作用,調節(jié)人視網膜血管內皮細胞基因表達和蛋白翻譯;此外,還有部分circRNA與表觀遺傳修飾相關,可以影響人視網膜血管內皮細胞基因表達和功能[12-13]。而人視網膜血管內皮細胞在維持視網膜血管壁結構和功能上發(fā)揮著關鍵的作用[14]。高血糖狀態(tài)下,視網膜血管內皮細胞的功能異常,會導致視網膜微循環(huán)障礙,進而引發(fā)糖尿病視網膜病變[15]。因此,調控人視網膜血管內皮細胞生物學功能對控制DR進展具有重要作用。

1.2.5 Western blot:采用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的總蛋白質,然后用BCA蛋白質濃度檢測試劑盒測定蛋白質的濃度。將蛋白質通過10%的SDS-PAGE電泳分離,并將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。5% 脫脂牛奶封閉膜 2 h,使用含有 0.1% Tween-20 (TBST) 的 TBS 洗滌 ,然后在4 ℃下與一抗共同孵育過夜。第2天,將膜與二抗一起在25 ℃下孵育2 h。使用ECL試劑盒來分析蛋白質的表達水平。其中,GAPDH作內參計算各組蛋白相對表達量。

2 結 果

2.3 circFAM73A能夠靶向結合miR-140-3p 為驗證circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的具體作用機制。circFAM73A和miR-140-3p存在結合位點(圖3A),雙熒光素酶基因報告結果顯示circFAM73A-WT組中轉染miR-140-3p mimics后雙熒光素活性明顯下降(圖3B,P<0.05),RIP結果顯示circFAM73A和miR-140-3p能夠結合Ago2蛋白,在轉染miR-140-3p mimics能夠增加Ago2蛋白和circFAM73A的結合(圖3C,P<0.05)。miR-140-3p的表達水平在HG組顯著降低(圖3D,P<0.05),在HG組轉染si-circRNA FAM73A后,miR-140-3p的表達水平明顯高于HG+si-nc組(圖3D,P<0.05)。這提示circFAM73A能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p。

注:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001A:RT-qPCR檢測circFAM73A表達水平;B、C:流式細胞術檢測細胞凋亡情況;D、E:Western blot檢測凋亡相關分子Cleaved caspase 3表達水平圖1 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡的影響

布魯諾走下法庭前又轉過身來大聲說道：“我看見了，你們在宣判時比我更害怕！”這聲音嗡嗡地在教堂里回響。主教們趕忙擦著汗，夾起文件匆勿散去。

2.2 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子釋放的影響 HG組細胞遷移(圖2A,P<0.05)和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平(圖2B、C,P<0.05)明顯高于NG組,HG+si-circRNA FAM73A組細胞遷移(圖2A,P<0.05)和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平(圖2B、C,P<0.05)明顯低于HG+si-nc組。這提示沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。

注: ****P<0.0001A:Transwell檢測細胞遷移情況;B、C:RT-qPCR檢測炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平圖2 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子釋放的影響

2.1 circFAM73A對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡的影響 對人視網膜血管內皮細胞分別采用5.5 mmol/L葡萄糖(NG組)或25 mmol/L葡萄糖(HG組)處理細胞,同時在HG組分別轉染si-nc(HG+si-nc組)和si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A組)。結果顯示circFAM73A的表達水平在HG組顯著升高(圖1A,P<0.05),在HG組轉染si-circRNA FAM73A后,circFAM73A的表達水平明顯低于HG+si-nc組(圖1A,P<0.05)。在人視網膜血管內皮細胞凋亡上,HG組細胞凋亡率明顯高于NG組(圖1B、C,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A組細胞凋亡率明顯低于HG+si-nc組(圖1B、C,P<0.05);HG組細胞凋亡相關分子Cleaved caspase 3的表達水平明顯高于NG組(圖1D、E,P<0.05),HG+si-circRNA FAM73A組細胞凋亡相關分子Cleaved caspase 3的表達水平明顯低于HG+si-nc組(圖1D、E,P<0.05)。這提示沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡。

Seepage calculation and discussion of double drainage blind ditch in finite thickness aquifer YE Kun WANG Xian-neng(68)

注:****P<0.0001A:circFAM73A和miR-140-3p結合位點;B、C:雙熒光素酶報告和RIP實驗證實circRNA FAM73A能夠靶向結合miR-140-3p;D:RT-qPCR檢測miR-140-3p表達水平圖3 circFAM73A能夠靶向結合miR-140-3p

2.4 circFAM73A/miR-140-3p軸對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的影響 為驗證circFAM73A/miR-140-3p軸對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的影響,在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中分別轉染si-circRNA FAM73A(HG+si-circRNA FAM73A組)、miR-140-3p inhibitors(HG+miR-140-3p inhibitors組)和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors(HG+si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors組)。結果顯示低表達miR-140-3p能夠顯著促進高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡(圖4A、B,P<0.05)、凋亡相關蛋白Cleaved caspase 3的表達水平(圖4C、D,P<0.05)、遷移(圖4E、F,P<0.05)、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放(圖4G、H,P<0.05)。共轉染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能夠顯著減弱單獨轉染miR-140-3p inhibitors對人視網膜血管內皮細胞凋亡(圖4A、B,P<0.05)、凋亡相關蛋白Cleaved caspase 3的表達水平(圖4C、D,P<0.05)、遷移(圖4E、F,P<0.05)、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放(圖4G、H,P<0.05)。這提示circFAM73A能夠通過靶向結合miR-140-3p調控高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。

社會大眾借助社會化媒體，比如微信、微博等媒體平臺將信息快速傳播出去。在其他社會受眾對照片或視頻進行轉發(fā)評論的同時，社會信息的傳播實現了更加多樣化的傳播。在文字和照片以及信息的傳播過程中，信息得到及時交互，傳受關系得到進一步擴散[1]。但實際上，網上的關系并不是一種人際關系，這是一種新型的社會角色關系，當這種關系借助手機和社會化媒體發(fā)展，媒介融合的特質也得到進一步顯現，社會化媒體中的用戶關系和用戶地位也會隨時發(fā)生改變。

3 討 論

1.2.7 RNA免疫沉淀(RIP):收集培養(yǎng)的人視網膜血管內皮細胞,并用RIP裂解緩沖液重懸。接下來,將細胞提取物與含有抗Ago2抗體或小鼠免疫球蛋白G(IgG)對照結合的磁珠RIP緩沖液在4 ℃下孵育過夜。次日,洗滌磁珠3次,并將磁珠與蛋白酶K一起孵育。使用Trizol試劑從提取物中分離出總RNA。最后,通過RT-qPCR分析確定circFAM73A和miR-140-3p的相對富集量。

在糖尿病患者中,高血糖水平會導致視網膜血管內皮細胞凋亡的增加,這會引起視網膜缺血、缺氧和代謝紊亂,從而誘發(fā)新生血管生成和病變進展[16-17]。研究顯示circSLC16A12可以調控miR-140-3p/FGF2軸抑制視網膜血管內皮細胞凋亡,進而減緩DR的進展[18]。circVEGFC能夠通過miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA軸加重高糖誘導的血管內皮細胞凋亡[19]。本研究結果顯示circFAM73A的表達水平高糖處理的人視網膜血管內皮細胞中明顯高表達,高糖能夠明顯誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡,而沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡。

總之，列寧“政治遺囑”中關于領導干部政治品格、大局意識和專業(yè)素質等方面的要求，指向的是當時俄共（布）的干部隊伍，對今天我們黨加強干部隊伍建設仍然具有重要的啟發(fā)意義。面對新形勢、新任務，我們黨在要求領導干部學習馬列主義、毛澤東思想，提高政治理論素養(yǎng)的同時，也要高度重視領導干部的專業(yè)知識學習，使他們全面提高業(yè)務素質。正如習近平總書記所強調的，領導干部要“結合工作來學習，不斷提高自己的知識化、專業(yè)化水平。要堅持干什么學什么、缺什么學什么，有針對性地學習掌握好領導工作、履行崗位職責所必備的各種知識，努力使自己成為行家里手、內行領導”[2]405。

在糖尿病患者中,視網膜血管內皮細胞遷移增加,血管生成加速,血管通透性增加,細胞外基質合成和降解失衡,導致了視網膜微血管的結構和功能的改變[20-21]。同時,在DR中高血糖會誘導視網膜血管內皮細胞的炎性反應,促進白細胞黏附和滲出,導致視網膜水腫、出血和缺氧等病理改變[20]。研究顯示沉默circ-UBAP2能夠通過調控miR-589-5p/EGR1軸抑制視網膜微血管內皮細胞遷移和氧化應激,繼而抑制DR進展[22]。研究顯示抑制circ-0002570可以通過miR-1243/angiomotin軸抑制高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞的血管生成和炎性反應[10]。在本研究中,高糖能夠明顯誘導人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放,而沉默circFAM73A能夠顯著抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞遷移和炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。這提示circFAM73A參與了高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。

為進一步探討circFAM73A對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞生物學功能的具體作用機制,雙熒光素酶報告和RIP實驗證實circRNA FAM73A能夠靶向結合miR-140-3p。miR-140-3p的表達水平在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中顯著降低,沉默circRNA FAM73A能夠促進miR-140-3p的表達,這提示circFAM73A能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p。研究顯示circ-0128846能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p調控骨關節(jié)炎的進展[23]。circRNA-0088036 能夠通過ceRNA機制靶向結合miR-140-3p促進膀胱癌的進展[24]。

隨著一批批商業(yè)銀行的成功上市和市場競爭的加劇，銀行正在走向市場主導型的營銷模式，也加快了我國商業(yè)銀行營銷模式的轉變進程[4]。但是，在營銷戰(zhàn)略和觀念上，這種觀念的轉變還不夠徹底。外資銀行在進入中國市場后一般采取輕表內業(yè)務、重表外業(yè)務；輕傳統(tǒng)存貸業(yè)務、重現代創(chuàng)新業(yè)務；輕市場份額、重盈利增長和輕負債業(yè)務、重資產業(yè)務的重點化競爭戰(zhàn)略。相對外資銀行來說，我國城市商業(yè)銀行利潤的主要來源仍舊是傳統(tǒng)的存貸業(yè)務，因此，我國的城市商業(yè)銀行在一定程度上仍舊墨守過去的營銷策略和營銷理念。

研究顯示miR-140-3p在DR中顯著低表達,circRNA-0084043能夠通過靶向結合miR-140-3p促進高糖誘導的ARPE-19細胞凋亡、氧化應激和炎癥因子釋放[25]。本研究在恢復實驗中,在高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞中分別轉染si-circRNA FAM73A、miR-140-3p inhibitors和si-circRNA FAM73A+miR-140-3p inhibitors。結果顯示低表達miR-140-3p能夠顯著促進高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移、炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放;共轉染si-circRNA FAM73A和miR-140-3p inhibitors能夠顯著減弱低表達miR-140-3p對人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放的作用。因此,沉默circFAM73A能夠通過靶向結合miR-140-3p抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡、遷移和炎癥因子釋放。