成鏡　黃天帶　戴雪梅　徐正偉

關(guān)鍵詞：橡膠樹；花藥；胚性愈傷組織；植株再生

中圖分類號：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

橡膠樹體胚植株具有生長快、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，其產(chǎn)量較同源老態(tài)芽接無性系增加了25.8%～66.3%[1-3]，生長快10%～20%[1]，是天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新一代種植材料。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所（以下簡稱“中國熱科院橡膠所”）組培與轉(zhuǎn)基因課題組建立了以花藥為外植體的橡膠樹熱研7-33-97 品種的體胚發(fā)生再生技術(shù)體系，目前能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的橡膠樹品種僅熱研7-33-97，橡膠樹體胚植株品種覆蓋度不足限制了其應(yīng)用面積。因此，為了提高橡膠樹體胚植株的推廣應(yīng)用面積，亟待研發(fā)其他優(yōu)良品種的體胚再生技術(shù)體系。

橡膠樹熱墾628 品種具有生長快、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、冠幅小、宜植區(qū)域廣的優(yōu)點(diǎn)，是中國熱科院橡膠所自主選育的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“十四五”主推品種。通過對海南、云南、廣東3 個區(qū)域試驗(yàn)點(diǎn)適應(yīng)性試種的熱墾628 的系統(tǒng)觀測，整體表現(xiàn)出了速生、產(chǎn)量高、抗逆性好的特性及良好的適應(yīng)性，是具有較大推廣應(yīng)用價值的膠木兼優(yōu)品種[4]。膠園產(chǎn)值低是目前天然橡膠產(chǎn)業(yè)面臨的難題，在橡膠林下間作耐陰作物可提高膠園產(chǎn)值，由于熱墾628 樹型是單桿型，分支較少，是最適合林下間作的品種。常規(guī)膠園每667 m 種植33 株（株行距3 m×7 m），中國熱科院橡膠所進(jìn)行示范種植的寬窄行（株距2 m，窄行距4 m，寬行距20 m）種植每667 m 種植28 株，使用體胚苗理論上可以增產(chǎn)20%，達(dá)到節(jié)本增效的效果。

為了成功地建立橡膠樹體胚發(fā)生再生技術(shù)體系，首先需要獲得較高質(zhì)量的胚性愈傷組織，否則難以進(jìn)行后續(xù)的體胚發(fā)生和植株再生過程。為了誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，研究者們從基因型[5]外植體類型[6-7]植物生長調(diào)節(jié)劑[8]、蔗糖、鈣[9-10]、其他添加物[11]等方面進(jìn)行研究，但效果不明顯。

本研究以橡膠樹雄花花蕾為材料，通過改變培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑、蔗糖、氨基酸、鈣含量、硝酸銀等研究其對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期在較短的時間內(nèi)獲得胚性愈傷組織，為后續(xù)的體胚發(fā)生再生技術(shù)體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植于中國熱科院試驗(yàn)場三隊(duì)的橡膠樹熱墾628 品種的花藥為材料，在春花期采集花蕾長度為2.5～3.0 mm、顯微鏡觀察花粉粒處于單核期且發(fā)育良好的雄花進(jìn)行接種培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 花藥愈傷的誘導(dǎo) 摘取新鮮的雄花花蕾，75%的乙醇處理30 s，0.1%的HgCl 溶液浸泡10 min，浸泡期間不?；蝿?，使滅菌徹底，無菌水沖洗4～5 次，每次5 min。解剖針剝開花蕾，將花藥柱連同花藥接種于試管中，每管接種4 個花藥外植體。滅菌和接種均在超凈工作臺上進(jìn)行。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將經(jīng)過無菌消毒的橡膠樹雄蕊接種于含有MS 大量、MS 微量、MS 有機(jī)、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L 硫胺素，不同毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度的培養(yǎng)基中，并補(bǔ)充天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸、鹽酸鹽50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝膠2.2 g/L，毒莠定、KT、6-BA、IAA 濃度采用五因素四水平正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1）；培養(yǎng)容器為帶透氣膜的玻璃試管，pH 5.8，在溫度為28 ℃的條件下培養(yǎng)30 d。采用五因素四水平L16（45）正交表設(shè)計(jì)，分別設(shè)置毒莠定濃度（因素A）、KT 濃度（因素B）、6-BA 濃度（因素C）、IAA 濃度（因素D）的五因素四水平正交試驗(yàn)（表2）。每個處理組合40 個外植體，重復(fù)3 次，接種20 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)情況。

1.2.3 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo) 將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)以測試其是否為胚性愈傷，體胚發(fā)生為25 ℃暗培養(yǎng)。體胚發(fā)生培養(yǎng)基配方參照黃天帶等[12]的配方。每個處理重復(fù)3 次，每個處理2 皿，每個處理共20 個外植體，轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基后45 d，統(tǒng)計(jì)體胚誘導(dǎo)率。

1.2.4 植株再生測試 將上述獲得的正常體胚轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基中進(jìn)行植株再生，植株再生培養(yǎng)基參考華玉偉等[13]的配方及培養(yǎng)條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019 和SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理和分析，用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

從表3 可以看出，不同培養(yǎng)基配方對愈傷誘導(dǎo)率的影響不同，其中處理8、12 愈傷誘導(dǎo)率最高，均達(dá)到100%；其次分別是處理9、10，愈傷誘導(dǎo)率均達(dá)93.3%；處理5 的愈傷誘導(dǎo)率最低，為63.3%。結(jié)果表明，處理8、9、10、12 與其余處理之間差異顯著，而處理1、2、3、4、6、7、14、16 之間無差異顯著。

從正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析（表4）可以看出，毒莠定濃度（因素A）對愈傷誘導(dǎo)率的影響較大，而KT 濃度（因素B）和6-BA 濃度（因素C）以及IAA 濃度（因素D）對其影響次之。從表4 的極值可確定4 個因素對愈傷誘導(dǎo)率影響程度順序?yàn)椋篈>B>C＞D；根據(jù)表4 中各因素水平均值的大小，可得愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)組合為ABCD， 即毒莠定濃度20 mg/L 、KT 濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。

2.2 不同處理愈傷組織誘導(dǎo)情況

從圖1 可以看出，處理9、10、11、12 的愈傷組織表面有一些光滑且球形的愈傷組織，而其余處理中很少看見有這種類型的愈傷組織產(chǎn)生。

2.3 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)結(jié)果分析

從表5 可以看出，處理1、2、3、4、5、6、7、8、13、15 均未誘導(dǎo)出體胚，體胚誘導(dǎo)率均為0。處理10 的體胚誘導(dǎo)率最高，顯著高于其余處理，體胚誘導(dǎo)率由高到低依次為處理10＞處理9＞處理11＞處理14＞處理12＞處理16，分別為33.3%、18.3%、16.7%、13.3、11.7%、6.7%。處理11、12、14 之間無顯著差異。

從圖2 可以看出，處理9、10、11 雖然能長出體胚，但是多為不正常的體胚，僅有處理14 能產(chǎn)生個別正常體胚。

2.4 植株再生情況分析

從體胚發(fā)生培養(yǎng)基中挑選出11 個較正常的體胚，轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再生（圖3），其中出苗2 株，7 個只長根不抽芽，2 個既不抽芽也不長根，植株再生率為18%。

3 討論

在橡膠樹中，胚性愈傷組織的獲得主要有花藥培養(yǎng)和內(nèi)珠被培養(yǎng)2 種途徑。其中，花藥培養(yǎng)是橡膠樹離體培養(yǎng)中研究最多的一個方向，也是橡膠樹生物技術(shù)育種的主要途徑[14]。經(jīng)由花藥培養(yǎng)獲得的易碎胚性愈傷組織可通過繼代培養(yǎng)快速增殖，再進(jìn)行批量的體胚誘導(dǎo)和植株再生[15]，或者進(jìn)行懸浮培養(yǎng)建立胚性懸浮細(xì)胞系，以此作為原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳分離材料[16]。因此，如何獲得良好的胚性愈傷組織對開展后續(xù)的研究具有重要的研究意義。

本研究明確了橡膠樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)組合為ABCD，即毒莠定濃度20 mg/L、KT濃度2 mg/L、6-BA 濃度1 mg/L、IAA 濃度0 mg/L。本研究結(jié)果表明，對胚性愈傷的誘導(dǎo)起主要作用的是毒莠定濃度，其濃度在20～30 mg/L 之間時，對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。低濃度的毒莠定雖然也能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，但是這些愈傷組織幾乎為無胚胎發(fā)生能力的非胚性愈傷組織。

在體胚誘導(dǎo)階段所用培養(yǎng)基為橡膠樹熱研7-33-97 品種的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，產(chǎn)生的多為不正常的體細(xì)胞胚，可能是由于體胚發(fā)生的基因型依賴所致，今后的研究中也需要針對熱墾628 品種研發(fā)針對性的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本研究所有處理在誘導(dǎo)愈傷組織25～28 d，愈傷組織達(dá)到快速增殖時期，為了更好地確定愈傷組織的生長發(fā)育狀態(tài)，今后要更加關(guān)注25 d 以前的愈傷組織狀態(tài)，在該研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，使其能更快地從花藥誘導(dǎo)胚性愈傷，縮短胚性愈傷誘導(dǎo)時間，降低變異發(fā)生機(jī)率，以及為引進(jìn)法國RITA培養(yǎng)系統(tǒng)提供更好的起始培養(yǎng)材料。本研究中植株再生率為18%，遠(yuǎn)低于熱研7-33-97 的70%左右，原因可能有以下兩方面，一是所使用的體胚還不夠成熟，二是所使用的植株再生培養(yǎng)基不適用于橡膠樹熱墾628 品種植株再生。有1 株移栽于沙床中進(jìn)行馴化。但由于移栽時工人不慎將葉片弄掉以及后期管理不到位，很遺憾最終沒能移栽成活。由于初次誘導(dǎo)的植株較少，且沒有移栽成活，所以未對其進(jìn)行遺傳變異檢測，但是從植株的葉片形態(tài)和株高上看，無明顯變異特征。