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        基于HS-SPME-GC-MS分析墨蘭不同花器官香氣成分

        2023-11-11 15:55:02丁麗瓊羅清覃茜唐毓瑋呂麗蘭池昭錦
        熱帶作物學(xué)報 2023年9期

        丁麗瓊 羅清 覃茜 唐毓瑋 呂麗蘭 池昭錦

        關(guān)鍵詞:墨蘭;花器官;香氣;HS-SPME-GC-MS

        中圖分類號:S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

        墨蘭( Cymbidium sinense ) 為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium Sw.)的地生植物,因其葉形優(yōu)美、品種豐富、花期恰逢春節(jié)而深受消費者歡迎[1]。墨蘭為國蘭代表性種類之一,其花香馥郁、沁人心脾[2],為優(yōu)質(zhì)香料物質(zhì),具有很高的經(jīng)濟價值和觀賞價值[3]。香氣是構(gòu)成和影響花卉觀賞價值的重要因素,但由于花香的成分、結(jié)構(gòu)及其生物合成過程比較復(fù)雜,研究水平滯后于花形、花色等其他觀賞性狀的研究[4]。近年來由于分析技術(shù)的進(jìn)步,對蘭科植物香氣研究逐漸增多。BAEK 等[5]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對大花蕙蘭新雜交種陽光之鐘盛花期花器官揮發(fā)物進(jìn)行了測定,鑒定出23 種成分,其中柱中鑒定出12種化合物,唇瓣中鑒定出16 種化合物,萼片中鑒定出11 種化合物,花瓣中鑒定出9 種化合物。王元成等[6]采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 技術(shù),對5種石斛花朵的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,共鑒定出110個揮發(fā)性成分,主要成分為烷類、烯類、醇類、酮類等,且不同石斛花朵的芳香成分不盡相同。晉宇軒等[7]采用SPMG 結(jié)合GC-MS 技術(shù)對貴州春蘭的花苞和花朵進(jìn)行檢測,結(jié)果檢測出揮發(fā)性成分分別為43 種和47 種,花苞中烴類含量最高,花朵中萜烯類的含量最高,橙花叔醇為主要花香成分。楊慧君等[8]采用SPME-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)分析小桃紅花香成分,共鑒定出揮發(fā)性成分35 種,酯類物質(zhì)含量最多,主要花香成分為茉莉酸甲酯、茉莉酮酸甲酯和金合歡醇。許紅娟等[9]采用頂空固相萃取法結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜對蕙蘭守良梅花朵各部位(蕊柱、唇瓣、棒瓣、主瓣和副瓣)進(jìn)行香氣成分檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕙蘭守良梅花朵蕊柱的主要香氣成分有7 類23 種,花朵5 個部位的醇類芳香物質(zhì)相對含量較高。魏丹等[10] 采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用分析3 種蘭花鮮花的香氣成分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕙蘭鮮花的主要花香成分為桉油精、(E)-4-己基葵烯-6-炔等,墨蘭鮮花的主要花香成分為甲基-異丁子香酚、6-氧代庚酸甲酯等,春蘭鮮花的主要花香成分為α-芹子烯、十二烷等。目前未見墨蘭不同花器官的揮發(fā)性物質(zhì)成分的相關(guān)研究報道。鑒于此,本研究以墨蘭為材料,基于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)探索墨蘭不同花器官的花香成分的差異,以期為培育香型蘭花新品種奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本研究所用的材料為廣西亞熱帶作物研究所蘭花種質(zhì)資源圃培育多年生的墨蘭植株。在1 月份晴天10:00—11:00 選取開放第4 天盛花期的墨蘭花朵(圖1),取萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱4個部分各1 g(重復(fù)3 次),用于香氣成分測定,使用頂空固相微萃取方法萃取樣品中的香氣成分。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品前處理 將新鮮花朵的不同器官樣品加一級水混勻至50 mL 離心管中,分別取5 mL待測樣品、1.00 g 氯化鈉和10 μL 內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇,1.0018 g/L)置于20 mL 樣品瓶中,迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊,移至加熱和攪拌裝置中,在40 ℃下加熱攪拌30 min,攪拌速度為500 r/min。

        1.2.2 頂空固相微萃取(HS-SPME) 使用SPME萃取頭(50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS, Supelco,Bellefonte, PA., USA)與CTC CombiPAL 自動進(jìn)樣器(CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)相連進(jìn)行自動化的頂空固相微萃取。經(jīng)過前處理的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱分別取1 g 放入萃取瓶中,萼片、花瓣及唇瓣分別置于1 L 的萃取瓶中,蕊柱分別置于60 mL 萃取瓶中,50 ℃平衡10 min后,將已活化SPME 萃取頭插入萃取瓶的頂空部分,萃取30 min。之后取出SPME 萃取頭,立即插入GC 進(jìn)樣口在250 ℃條件下解析8 min。

        1.2.3 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)條件 采用Agilent 6890 氣相色譜儀與Agilent 5975 質(zhì)譜儀相連,色譜柱采用HP-Innowax 毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm ×0.25 μm,J&W Scientific,F(xiàn)olsom,CA)分離鑒定芳香揮發(fā)物。

        氣相色譜條件:載氣(He)流速為1 mL/min;采用不分流模式自動進(jìn)樣,升溫程序為50 ℃保持1 min,然后以3 ℃/min 升溫至220 ℃,保持5 min。

        質(zhì)譜條件:質(zhì)譜接口溫度為280 ℃,離子源溫度為230 ℃,電離方式為EI,電離能為70 ev,質(zhì)譜掃描范圍為m/z 29-350。

        1.2.4 香氣物質(zhì)定性與定量分析方法 (1)定性分析。利用自動化質(zhì)譜圖解卷積和鑒定軟件(AMDIS)計算保留指數(shù)(retention index, RI)和質(zhì)譜圖信息。其中,有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)組分,與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和質(zhì)譜譜圖比較定性;沒有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)組分,通過保留指數(shù)與NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫的RI 和質(zhì)譜譜圖比對進(jìn)行定性分析?;衔锏谋A糁笖?shù)是通過分析相同色譜條件下C6-C24正烷烴保留指數(shù)計算得到。具體公式如下:

        式中,I 為保留指數(shù),t,t,t分別代表組分及碳數(shù)為n,n+1 正構(gòu)烷烴的保留時間。

        (2)定量分析。配置1 L 含7 g/L 酒石酸和200 g/L 模擬水溶液,并用NaOH 調(diào)pH 至3.4。將溶解在乙醇(色譜級)的所有標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合,并將混合液用模擬水溶液稀釋成連續(xù)的15 個濃度水平。在與樣品相同的條件下,提取并分析每個濃度水平的香氣標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過建立香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo):香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇的峰面積比,縱坐標(biāo):該香氣化合物標(biāo)樣的濃度),對相關(guān)香氣化合物進(jìn)行定量分析。除此之外,其他沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的化合物通過相似結(jié)構(gòu)的化合物或者碳原子數(shù)相似的化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[11]。相對含量為組分峰面積占總峰面積的百分比[12]。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        各組分質(zhì)譜經(jīng)計算機譜庫檢索及資料分析并結(jié)合人工譜圖解析,確認(rèn)各個化學(xué)成分。使用Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 墨蘭不同花器官揮發(fā)化合物組成

        經(jīng)過GC-MC 分析,從墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發(fā)性成分,主要由21 種醛類、12 種醇類、10 種酮類、5 種苯類、2 種呋喃類、2種酸類和2 種萜類化合物組成,其中醛類含量最高(圖2)。在不同器官中各種主要成分的含量不同,在萼片中醇類較其他3 個器官少,而酸類則較其他器官多1 種,花瓣及唇瓣中醛類較其他器官少1種,萼片及唇瓣中酮類較其他器官少。

        在不同花器官中,墨蘭花的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱檢測出的香氣成分分別有49、51、48 和51 種。蕊柱及花瓣香氣的組成成分最多,其次是萼片,唇瓣較少。不同花器官揮發(fā)成分見表1。由圖3 可知,4 種組織均含有的化合物有48 種,包括19 種醛類(苯甲醛、2,4,-二甲基苯甲醛、丙醛、異戊醛、戊醛、巴豆醛、己醛、E-2-戊烯醛、庚醛、青葉醛、環(huán)戊基甲醛、(Z)-4-庚烯醛、E-2-庚烯醛、壬醛、(E,E)-2,4-己二烯醛 、E-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、鳶尾醛、2,4-辛二烯醛);10 種醇類(甲醇、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇、1-己醇、Z-3-己烯醇、蘑菇醇、2-丙基-1-戊醇、2-乙基己醇、E-2-辛烯醇、苯甲醇);9 種酮類(甲基異丁酮、1-戊烯-3-酮、2-庚酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3,5-辛二烯-2-酮、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、異佛爾酮);5 種苯類(甲苯、對乙基甲苯、1-乙基-2,4-二乙基苯、M-異丙基甲苯、1-溴萘);2 種萜類(茶螺烷、2,4-二叔丁基苯酚);2 種呋喃類(2-乙基呋喃、2-戊基呋喃);1 種酸類為己酸?;ò?、萼片及蕊柱共有成分3 種(2,3-戊二酮、桉葉油醇、丙炔醇)。只在萼片中檢測到有2 種(2-甲基-4-戊醛和戊酸),丙烯醛只在蕊柱檢測出。

        萼片中檢測出的香氣成分?jǐn)?shù)量中等但物質(zhì)含量最高,達(dá)99 106.15 μg/L,占總揮發(fā)性有機成分的35.88%。花瓣及蕊柱檢測出的香氣成分?jǐn)?shù)量比萼片多2 種,物質(zhì)含量分別為56 571.48、78 868.68μg/L, 分別占總揮發(fā)性有機成分的20.48%和28.56%。唇瓣中檢測出的香氣成分?jǐn)?shù)量最少,物質(zhì)含量也最少,為41 645.32 μg/L,占總揮發(fā)性有機成分的15.08%。因此,墨蘭不同花器官香氣成分及其含量存在差異,萼片揮發(fā)性物質(zhì)含量最高與感官上的初步判斷一致。

        在準(zhǔn)確定量的化合物中,醛類化合物含量最高,為239 760.71 μg/L;其次是醇類化合物為34 864.05 μg/L,苯類化合物為940.50 μg/L,酸類化合物為456.53 μg/L,酮類化合物為122.91 μg/L,萜類化合物為47.01 μg/L , 最少的呋喃類為0.15 μg/L。檢測到醛類化合物中含量最高的是環(huán)戊基甲醛;醇類化合物中含量最高的是1-戊烯-3-醇;苯類化合物中含量最高的是2,4,-二甲基苯甲醛;酸類化合物中含量最高的是己酸;酮類化合物中含量較高的是甲基庚烯酮;萜類化合物中含量最高的是2,4-二叔丁基苯酚;呋喃類化合物中含量較高的是2-戊基呋喃。

        2.2 墨蘭不同花器間香氣成分揮發(fā)量的差異

        各化合物揮發(fā)量在不同器官中存在著明顯差異,且每個器官化合物含量不同(表2)。萼片中有11 種化合物含量均較其他3 個器官含量高,其中環(huán)戊基甲醛在萼片中含量最高,為41 248.26 μg/L,其次是花瓣為17 659.45 μg/L,唇瓣及蕊柱含量遠(yuǎn)低于萼片,分別比萼片少35 053.29、33 941.80 μg/L,具有薄荷的樟腦味。1-戊烯-3-醇在花瓣中含量最高(4170.67 μg/L),具有水果香味。唇瓣中丙醛、1- 戊烯-3- 酮、E-2- 戊烯醛、E-2- 戊烯-1- 醇、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮等5 種化合物含量均較其他3 個器官含量高,具有水果清香味。蕊柱中有18種化合物含量均較其他3 個器官含量高,其中E-2-庚烯醛在蕊柱中含量高達(dá)1 174.91 μg/L,其次是唇瓣552.74 μg/L,在萼片及花瓣中的含量為191.59、160.43 μg/L,具有青草香和油脂香。

        2.3 不同花器官揮發(fā)物主成分分析

        為了進(jìn)一步反應(yīng)墨蘭不同花器官香氣物質(zhì)構(gòu)成的差異,對4 個不同花器官的54 個揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。對于不同花器官與揮發(fā)性成分之間(圖4),第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為61.8%,第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為25.8%,前2 個主成分占總方差的87.6%,能夠很好的保留樣本原來的信息。4 種花器官中唇瓣和花瓣位于同一象限,表明差異性小。蕊柱單獨在PC1、PC2 負(fù)方向上,說明與其他器官差異性大。萼片單獨在PC1正方向、PC2 負(fù)方向上,也與其他器官差異性大。戊醛(4)、己醛(6)、E-2-戊烯醛(7)、E-2-己烯醛(10)、環(huán)戊基甲醛(11)、E-2-庚烯醛(13)、1-戊烯-3-醇(23)、E-2-戊烯-1-醇(25)在PC1和 PC2 上的貢獻(xiàn)較高,說明這些成分是花器官香氣釋放的主要揮發(fā)性成分。1-戊烯-3-醇(23)在 PC1 的正方向上貢獻(xiàn)最大,與花瓣呈正相關(guān)關(guān)系,且在花瓣中含量最高。己醛(6)在PC2的負(fù)方向上貢獻(xiàn)最大,與蕊柱呈正相關(guān)關(guān)系,且在蕊柱中含量最高。

        3 討論

        花香是植物的重要特征[36],揮發(fā)性化合物的數(shù)量和類型是影響花香品質(zhì)的重要指標(biāo),也決定了蘭花的商業(yè)價值。我國傳統(tǒng)的觀賞蘭花包括春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭、寒蘭和蓮瓣蘭等系列,不同系列不同品種的蘭花香氣成分種類存在異同。不同品種蕙蘭[37]香氣成分主要為萜烯類、醇類、醛類、酯類、酮類、烷烴類和芳香烴,另有少量的酚類、酸類和醚類物質(zhì),建蘭品種小桃紅主要香氣成分為酯類[8],貴州春蘭揮發(fā)性成分和花香成分的主要物質(zhì)是萜烯類[7],不同花色寒蘭香氣成分主要有醇類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷類和酯類[38]。本研究中墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發(fā)性成分,主要由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成,其中醛類含量最高。

        花朵不同花器官所含的揮發(fā)物及含量差異明顯,不同品種花朵揮發(fā)性成分釋放的主要花器官也不同。徐慧等[39]研究表明牡丹不同部位之間的揮發(fā)性化合物種類和相對含量存在較大差異,周晨晨等[40]研究表明白蘭地海棠不同花器官的花香成分存在明顯差異,揮發(fā)性成分釋放的主要花器官是雌蕊。宋朝偉等[41]研究表明2 個芍藥品種花香成分在不同花器官之間香氣物質(zhì)的釋放量均呈現(xiàn)出明顯差異,釋放量最高的為瓣化雄蕊,與感官上香氣的初步判斷相吻合。本研究中,墨蘭萼片共檢測出49 種揮發(fā)物,物質(zhì)含量最高,其中含量最高的揮發(fā)物為環(huán)戊基甲醛,具有薄荷的樟腦味;蕊柱檢測出的揮發(fā)物物質(zhì)含量次之,其含量最高的揮發(fā)物為己醛,呈青草香氣;花瓣檢測出揮發(fā)物的物質(zhì)含量第三,其含量最高的揮發(fā)物為1-戊烯-3-醇,具有水果香味;唇瓣檢測出揮發(fā)物的物質(zhì)含量最低,其含量最高的揮發(fā)物為環(huán)戊基甲醛;萼片揮發(fā)性物質(zhì)含量最高與感官上的初步判斷一致,萼片是揮發(fā)性成分釋放的主要花器官。通過主成分分析發(fā)現(xiàn),4 種花器官中唇瓣和花瓣差異性小,蕊柱與其他器官差異性大,萼片也與其他器官差異性大。戊醛、己醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、環(huán)戊基甲醛、E-2-庚烯醛、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇是4 個花器官香氣釋放的主要揮發(fā)性成分,主要呈青草、水果香味。

        本研究表明,不同花器官中揮發(fā)性香氣成分種類組成相似,由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成。但不同花器官揮發(fā)物物質(zhì)含量不同,48 種共有物質(zhì)在不同花器官中物質(zhì)含量存在顯著差異。萼片物質(zhì)含量最高,因此盛花期墨蘭花朵萼片是揮發(fā)性成分釋放的主要花器官。不同花器官的花香成分物質(zhì)含量存在明顯差異,這為研究香型蘭花新品種選育及香氣形成機制提供參考依據(jù)。

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