劉榮　張正學(xué)　劉清國(guó)　黨志國(guó)　吳小波　黃海

關(guān)鍵詞：杧果；SSR 標(biāo)記；毛細(xì)管電泳；DNA 指紋圖譜；DNA 分子身份證

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

杧果（Mangifera indica Linn.），是一種熱帶亞熱帶常綠喬木果樹(shù)，屬漆樹(shù)科（Anacardiaceae）杧果屬（Mangifera）[1-2]。因其果實(shí)香甜、營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細(xì)滑多汁，被稱(chēng)為“熱帶果王”，備受消費(fèi)者青睞[3]。杧果原產(chǎn)于印度，我國(guó)于20 世紀(jì)初引進(jìn)象牙杧杧果，已收集保存杧果種質(zhì)資源1000 余份，結(jié)合實(shí)生選種、雜交育種等育種方法創(chuàng)制了熱農(nóng)1 號(hào)、紅玉杧、桂熱82 號(hào)等優(yōu)良品種[4]。以杧果品種阿方索為試材，通過(guò)測(cè)序和組裝得到了393 Mb 的基因組圖譜[5]。目前，我國(guó)杧果主要種植在海南、廣西、四川等熱帶亞熱帶地區(qū)，其種植面積達(dá)343 400 hm2，產(chǎn)量達(dá)331.2 萬(wàn)t，居世界第二位[6-7]。

目前，應(yīng)用于杧果遺傳育種的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR[8]、RAPD[9]、AFLP[10]等。SSR（simplesequence repeats， SSR）標(biāo)記是一種以特異引物PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高；以孟德?tīng)柗绞竭z傳，呈共顯性；技術(shù)重復(fù)性好、易操作等特性[11]。近年來(lái)，SSR 標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建，在水稻[12]、大豆[13]以及黃瓜[14]等作物上已有報(bào)道。孫浩男等[15]利用MISA 軟件以金雞菊為試材，檢測(cè)得到6546 個(gè)SSR 位點(diǎn)；結(jié)合引物篩選成功開(kāi)發(fā)出22 對(duì)多態(tài)性較好的引物，擴(kuò)增得到166 個(gè)多態(tài)性條帶。馮鵬龍等[16]以辣椒為試材，篩選得到6 對(duì)多態(tài)性較好的引物，共擴(kuò)增到36 個(gè)基因位點(diǎn)，多態(tài)性比例為97% ； 并選用pepperSSR01 、pepperSSR04、pepperSSR06、pepperSSR08 構(gòu)建了供試?yán)苯凡牧系闹讣y圖譜。董聚苗等[17]利用28f4、CH04f10、GD142 共3 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了74 個(gè)觀賞海棠品種的指紋圖譜。本研究采用SSR標(biāo)記構(gòu)建19 份杧果品種（系）的DNA 指紋圖譜和DNA 分子身份證，旨在為杧果遺傳育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料于2020 年9 月在貴州省興義市南盤(pán)江鎮(zhèn)田房村收集。采集杧果秋稍上的幼嫩葉片，將葉片用吸水紙吸干后放入裝有變性硅膠的采樣袋中，寫(xiě)好標(biāo)簽后帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 試劑與儀器 Taq Plus DNA 聚合酶、10×PCR Buffer（含Mg）、dNTPs（10 mmol/L）、50×TAE、瓊脂糖H 等均采購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，6×DNA Loading Dye、DNALadder Mix（100～3000 bp）、POP-7 Polymer和HiDiForma-mide 采購(gòu)于ThermoFisher （AppliedBiosystemsTM）公司。

VeritiTM 96well 型PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；FR-980A 型凝膠成像儀購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司；3730XL 型測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；SMA4000型UV-Vis Spectrophotometer 購(gòu)自Merinton 公司；TD5A-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；F619703-05 型BP 系列精密單道可調(diào)移液器購(gòu)自加拿大BBI 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 以杧果幼嫩葉片為原材料，采用Ezup 柱式植物組織基因組DNA 抽提試劑盒提取杧果基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)（產(chǎn)品編號(hào)：B518261）。

1.2.2 SSR 分析 所用SSR 標(biāo)記引物序列來(lái)源于前人的研究開(kāi)發(fā)[18-20]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：10 μmol/L正反向引物各 0.5 μL，5 μmol/L dNTPs 0.5 μL，10×Taq buffer （含Mg2+） 2.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，20～50 ng/μL 基因組DNA 1 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃保存。引物篩選時(shí)，PCR 產(chǎn)物通過(guò)PAGE 檢測(cè)；毛細(xì)管電泳時(shí)，將篩選得到的SSR 引物進(jìn)行5修飾，得到的PCR 產(chǎn)物使用3730XL 設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Genemapper 軟件分析獲得擴(kuò)增片段大小。DNA 指紋圖譜代碼、DNA 分子身份證的構(gòu)建參照郭艷春等[21]和李志強(qiáng)等[22]的方法，即：將每一對(duì)引物擴(kuò)增得到的所有等位基因按照從小到大的順序進(jìn)行排列，先用數(shù)字1～9 依次排序，超出9 的部分用字母順序排列，構(gòu)建形成19 個(gè)杧果品種（系）的指紋圖譜代碼。每個(gè)品種的條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證分別在網(wǎng)址http：//t-x-m.com/和http：//t-x-m.com/QRCode/QRCodeGenerator.asp 上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 19 個(gè)杧果品種（系）的基本特性

19 個(gè)杧果品種（系）主要從廣西、海南引進(jìn)以及貴州自育品系中獲得，其中8 個(gè)品系處于中期試驗(yàn)階段，待鑒定；11 個(gè)品種（系）是單胚，8 個(gè)品種（系）是多胚；其基本特性如表1 所示。

2.2 引物篩選

根據(jù)所選材料的表型特征，選擇其差異較大的5 份杧果材料（紅象牙杧、金煌杧、紅杧6 號(hào)、紅玉杧、南逗邁4 號(hào)杧）為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增以及PAGE 電泳檢測(cè)，從115 對(duì)引物中篩選得到穩(wěn)定性較好、多態(tài)性較高的引物9 對(duì)，并采用HEX、FAM 兩個(gè)熒光標(biāo)記對(duì)引物進(jìn)行5端修飾（毛細(xì)管電泳檢測(cè)備用），引物詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

2.3 DNA 指紋圖譜構(gòu)建

對(duì)篩選得到的9 對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記后，毛細(xì)管電泳檢測(cè)19 份杧果品種（系），構(gòu)建其DNA指紋圖譜。擴(kuò)增片段大小通過(guò)數(shù)字和字母對(duì)每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行編碼，如表3 所示，9 對(duì)引物擴(kuò)增得到多態(tài)性條帶數(shù)158 條，其中引物M53 含有19 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，從小到大依次是：167.44/175.74（1）、167.44/188.75（2）、168.34/176.5（3）、168.4/184.64（4）、168.42/176.72（5）、168.58/176.81（6）、175.6/179.53（7）、175.63/179.6（8）、176.48/184.63（9）、176.58/182.55（A）、176.61（B）、176.64/182.62（C）、176.69/182.61（D）、176.69/188.69（E）、176.71/182.57（F）、176.79/182.72（G）、176.85/188.87（H）、177.5/179.55（ I ） 、177.65/181.71（J）。

依據(jù)表3 的多態(tài)性片段編碼，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 順序，通過(guò)每個(gè)品種對(duì)應(yīng)的每個(gè)引物多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行組合統(tǒng)計(jì)，構(gòu)建形成19 份杧果品種（系）的指紋圖譜代碼（表4）。如金煌杧，通過(guò)9 個(gè)SSR 位點(diǎn)毛細(xì)管電泳檢測(cè)得到帶型（圖1），統(tǒng)計(jì)分析形成其指紋圖譜代碼為9EE9F8933，對(duì)應(yīng)表3 表示第1 個(gè)數(shù)字9 表明杧果品種金煌杧對(duì)應(yīng)引物M9 的擴(kuò)增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第9；第2 個(gè)字母E 表明杧果品種金煌杧對(duì)應(yīng)引物M15 的擴(kuò)增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第14；第3 個(gè)字母E 表明杧果品種金煌杧對(duì)應(yīng)引物M35 的擴(kuò)增片段在該引物多態(tài)性片段梯度中排第14；后續(xù)代碼以此類(lèi)推。將19 個(gè)品種（系）的指紋圖譜代碼和基本信息導(dǎo)入在線(xiàn)條形碼生成程序、二維碼生成程序，得到各品種的條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證（表4）。

3 討論

由于SSR 標(biāo)記具有共顯性、等位變異多、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于果樹(shù)DNA 指紋圖譜構(gòu)建。本研究從115 對(duì)引物中初步篩選得到多態(tài)性較好的引物9 對(duì)，毛細(xì)管電泳檢測(cè)19 份杧果品種（系），依據(jù)擴(kuò)增片段大小對(duì)每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行編碼，9 對(duì)引物擴(kuò)增得到多態(tài)性條帶數(shù)158 條，其中引物M53 含有19 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，這與黃麗芳等[23]、王明等[19]的研究結(jié)果相似。

DNA 分子身份證由于可以直觀便捷呈現(xiàn)品種信息，在品種識(shí)別、鑒定等方面得以廣泛應(yīng)用。武志江等[24]采用20 對(duì)SSR 標(biāo)記引物，結(jié)合數(shù)字和小寫(xiě)字母對(duì)145 份火龍果不同帶型進(jìn)行編碼，成功構(gòu)建了火龍果種質(zhì)資源的DNA 分子身份證，實(shí)現(xiàn)不同種質(zhì)資源的有效區(qū)分。侯麗媛等[25]選取7 對(duì)熒光SSR 引物，并運(yùn)用條形碼技術(shù)生成了‘赤霞’的分子身份證。白曉倩等[26]利用6 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了55 份板栗品種的DNA 分子身份證，這對(duì)板栗品種的識(shí)別和鑒定提供了參考價(jià)值。相對(duì)這些果樹(shù)來(lái)說(shuō)，SSR 分子標(biāo)記在杧果DNA 分子身份證構(gòu)建方面的應(yīng)用相對(duì)較少。本研究通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到多態(tài)性片段編碼，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 順序?qū)?9 份杧果品種（系）的指紋圖譜代碼進(jìn)行編輯，構(gòu)建了19 份杧果品種（系）的DNA分子身份證，為標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建杧果DNA 分子身份證庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以19 個(gè)杧果品種（系）為試材，利用熒光標(biāo)記的9 對(duì)引物，通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)后，結(jié)合“數(shù)字+字母”處理獲得19 個(gè)杧果品種（系）的指紋圖譜代碼、條形碼DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證，為標(biāo)準(zhǔn)化構(gòu)建杧果DNA分子身份證庫(kù)奠定基礎(chǔ)。