聶智毅　康桂娟　覃懷德　曾日中

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；HbSRPP7；膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)；cDNA 文庫(kù)；互作蛋白

中圖分類號(hào)：S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

天然橡膠（順式-聚異戊二烯，橡膠烴）作為重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資廣泛應(yīng)用于人們的日常生活、交通運(yùn)輸、軍事裝備及航空航天等領(lǐng)域，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)和國(guó)防建設(shè)中具有重要的戰(zhàn)略地位。天然橡膠產(chǎn)業(yè)是一種典型的資源約束型產(chǎn)業(yè)，在生產(chǎn)地域和產(chǎn)品性能上具有不可替代性。天然橡膠主要來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)（ Hevea brasiliensis Muell. Arg.，簡(jiǎn)稱橡膠樹(shù)）乳管細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的橡膠粒子[1]。橡膠粒子是橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中的一種特殊細(xì)胞器，作為橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的主要成分，其體積約占膠乳總體積的30%～45%，是橡膠生物合成及其產(chǎn)物最終貯藏的場(chǎng)所[2]。橡膠生物合成的整個(gè)過(guò)程涉及乳管細(xì)胞產(chǎn)膠代謝的一系列生化反應(yīng)，其中發(fā)生在橡膠粒子上橡膠分子的起始、延長(zhǎng)和終止是橡膠生物合成的關(guān)鍵步驟。橡膠粒子上的蛋白質(zhì)（酶）在這一系列反應(yīng)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們直接決定著橡膠烴分子的數(shù)量和大小，從而影響著天然橡膠的產(chǎn)量和質(zhì)量。深入研究橡膠粒子蛋白的功能，分析其與橡膠生物合成之間的關(guān)系，對(duì)揭示橡膠生物合成及其分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。DAI 等[3]提取洗滌過(guò)的橡膠粒子蛋白并采用“Shotgun（鳥槍法）”質(zhì)譜分析，鑒別了186 個(gè)橡膠粒子蛋白，其中已知參與橡膠生物合成的橡膠粒子蛋白主要有3種，分別是橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（small rubber particleprotein， SRPP ） 和順式- 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase， CPT）。除此之外，橡膠粒子上存在調(diào)控橡膠生物合成的焦磷酸酶[4]以及其他功能未知的蛋白[3]。REF、SRPP 及CPT 等蛋白可能通過(guò)相互作用，形成蛋白復(fù)合體[5-8]，在橡膠粒子上催化800～20 000 個(gè)IPP 分子中的異戊二烯基順式聚合，形成多聚順式異戊二烯（即天然橡膠分子），但這些橡膠粒子蛋白的具體功能及作用機(jī)制仍有待更深入研究[9]。SRPP 是豐度僅次于REF 的橡膠粒子蛋白組分，與橡膠粒子發(fā)育和橡膠生物合成密切相關(guān)[10-11]。DAI 等[3]研究表明，橡膠粒子上存在多個(gè)SRPP 蛋白，但大部分成員的功能尚未鑒定。進(jìn)一步鑒定橡膠粒子上SRPP家族其他成員的相互作用蛋白，有助于揭示橡膠粒子上參與橡膠生物合成的蛋白復(fù)合體組成，闡明橡膠生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制。HbSRPP7（GenBank 登錄號(hào)：XM_021791298.1）是一個(gè)在橡膠生物合成活躍度相對(duì)較低的大橡膠粒子上表達(dá)量較小橡膠粒子高的橡膠粒子蛋白，可能與大、小橡膠粒子的橡膠生物合成活性差異相關(guān)[12]，但其功能及其參與橡膠生物合成的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。本研究利用位點(diǎn)特異性重組技術(shù)構(gòu)建高質(zhì)量膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（membrane yeasttwo-hybrid system， MYTH）cDNA 文庫(kù)，使用DUALmembrane system 構(gòu)建pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體并進(jìn)行自激活及表達(dá)功能檢測(cè)。以pBT3STE-SRPP7 誘餌質(zhì)粒對(duì)膠乳MYTH cDNA 文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得21 個(gè)可能與HbSRPP7 互作的蛋白，為了解HbSRPP7 的功能及其功能發(fā)揮的機(jī)制，闡明橡膠生物合成的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以2000 年定植于海南省儋州市寶島新村的熱研7-33-97 品系橡膠樹(shù)膠乳為材料。多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司， Oligotex mRNA Kits 購(gòu)自Qiagen 公司，SuperScript Double-Stranded cDNASynthesis Kit 購(gòu)自Invitrogen 公司，Trimmer-2cDNA normalization kit 購(gòu)自Evrogen 公司，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 和DNA marker 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA 凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司，ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit 及Phanta EVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，DUALmembrane starter kit 購(gòu)自Dualsystems Biotech 公司，酵母缺陷培養(yǎng)基、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自Clontech 公司，DH5α 大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存，其余生化試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成及測(cè)序委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹(shù)膠乳RNA 提取和cDNA 合成 根據(jù)多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒說(shuō)明書提取橡膠樹(shù)膠乳總RNA，以分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度并參照Oligotex mRNA Kits 說(shuō)明書分離純化mRNA。參照SuperScript Double-StrandedcDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書合成cDNA 第一鏈以及第二鏈，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 橡膠樹(shù)膠乳MYTH系統(tǒng)cDNA 文庫(kù)制備及質(zhì)量檢測(cè) （1）cDNA 的均一化處理。將合成的34 μL cDNA 第二鏈加入以下反應(yīng)體系：10×T4Ligase buffer 5 μL，1 μg/μL 5'Adapter（序列為5'-GCAGAGTGGCCATTACGGCCACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3'）10 μL，40 U/μL T4 DNALigase 1 μL，混勻后于16 ℃放置16 h。加入10 mmol/L dNTPs 2 μL，T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃放置20 min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)2.5 倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，并用14 μL ddH2O 溶解沉淀物，取其中12 μL 參照Trimmer-2 cDNA normalizationkit 說(shuō)明書進(jìn)行均一化處理，切膠回收1000 bp 以上片段，溶解于14 μL ddHO 中。

（2）cDNA 文庫(kù)制備。按照DUALmembranestarter kit 以及ClonExpress Ultra One Step CloningKit 說(shuō)明書，使用位點(diǎn)特異性重組的方式，將14 μL均一化cDNA 與6 μL 線性化的MYTH 系統(tǒng)載體pPR3-N 加入50 μL 2×ClonExpress Mix，30 μLddHO，置于50 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入10 μL 10 μg/μL 的Proteinase K 滅活重組酶。并依次加入90 μL ddHO、20 μg/μL Glycogen 2 μL、7.5 mol/L NH4OAc 100 μL、無(wú)水乙醇750 μL，混合均勻并置于–80 ℃ 2 h。于4 ℃，16000 r/min離心30 min，去上清，加入150 μL 70%乙醇；4 ℃，16 000 r/min 離心3 min；重復(fù)此步驟1 次，小心去除上清，室溫晾干10 min。用10 μL ddHO 置冰上重懸沉淀。重組產(chǎn)物每2.5 μL 電轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入LB 培養(yǎng)基1 mL，合并4 次轉(zhuǎn)化后的菌液，用培養(yǎng)基補(bǔ)足至5 mL，置于37 ℃，以250 r/min 震蕩培養(yǎng)2 h 后，取2 μL 培養(yǎng)物梯度稀釋10、100、1000、10 000 倍，其余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）cDNA 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)。取轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌梯度稀釋液10 μL 涂布于氨芐抗性（100 μg/mL）LB 平板，培養(yǎng)16 h 后計(jì)數(shù)。CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/10× 稀釋倍數(shù)×1000 ， 文庫(kù)總CFU=CFU/mL×文庫(kù)菌液總體積（mL）。以無(wú)菌槍尖從原始文庫(kù)滴度測(cè)定平板上隨機(jī)挑取菌斑克隆，利用3'AD（5'-CTCGAGAGGCCGAGGCGGCC-3'）和5'AD（5'-GCAGAGTGGCCATTACGGCC-3'）引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)擴(kuò)增5 min；然后94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)插入片段大小。

（4）cDNA 文庫(kù)的擴(kuò)增與文庫(kù)質(zhì)粒提取。將上步檢驗(yàn)合格的原始cDNA 文庫(kù)，根據(jù)其庫(kù)容量，以每個(gè)涂布約3 萬(wàn)個(gè)克隆的密度鋪板培養(yǎng)于35 cm氨芐抗性（100 μg/mL）LB 培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)完成后以LB 液體培養(yǎng)基洗脫菌斑克隆，以質(zhì)粒大抽試劑盒抽提質(zhì)粒，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體構(gòu)建、自激活檢測(cè)及功能檢測(cè) 根據(jù)HbSRPP7的開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）序列以及ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 說(shuō)明書設(shè)計(jì)包含Sfi Ι 酶切位點(diǎn)引物（SRPP7-F：5'-GGATCTTCCAGAGATGGCCATTACGGCCATGGAGATGGAGAAGAAGAACCC-3'，SRPP7-R：5'-CTGCCGTTCGACGATGGCGCCTCGGCCCCATCCGAATCTGATGAATCATGTGC-3'。），用于擴(kuò)增HbSRPP7 的ORF 片段。PCR 反應(yīng)體系：PhantaEVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、稀釋50 倍的橡膠樹(shù)膠乳第一鏈cDNA 2 μL、5×EVOBuffe 10 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L的SRPP7-F 及SRPP7-R 引物各1 μL，以ddHO補(bǔ)至體積50 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)擴(kuò)增5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收擴(kuò)增條帶，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Sfi Ι 限制性內(nèi)切酶酶切誘餌載體質(zhì)粒pBT3STE 和pBT3SUC，切膠回收線性化載體片段，根據(jù)ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書將HbSRPP7 的ORF 片段克隆至pBT3STE 和pBT3SUC 載體的Sfi Ι 位點(diǎn)中，然后將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，以Sfi Ι 酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果將無(wú)移碼無(wú)堿基突變的重組質(zhì)粒分別命名為pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7。參照DUALmembrane starter kit 試劑盒說(shuō)明書，將各種質(zhì)粒組合（表1）轉(zhuǎn)入受體菌NMY32 中，培養(yǎng)4 d，記錄每塊篩選平板上的克隆數(shù)量，并計(jì)算其相對(duì)生長(zhǎng)率，對(duì)構(gòu)建的誘餌載體進(jìn)行自激活檢測(cè)及表達(dá)功能檢測(cè)。

1.2.4 HbSRPP7 互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證 使用pBT3STE-SRPP7 誘餌載體參照DUALmembranestarter kit 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與cDNA 合成

本研究提取的橡膠樹(shù)膠乳總RNA 的OD/OD為2.10，OD/OD 為1.88，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A 所示，呈現(xiàn)2 條相對(duì)集中的亮帶，帶型完整，邊緣清晰，說(shuō)明RNA 樣品的完整性好。分離的mRNA 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（圖1B）電泳顯示呈彌散狀分布，條帶分布均勻，紫外分光光度測(cè)定總量為6.5 μg，OD/OD280 為1.91，表明分離的mRNA 總量及純度滿足建庫(kù)要求。取5 μg mRNA 合成cDNA 第二鏈，進(jìn)行均一化處理后直接用于cDNA 文庫(kù)的制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與cDNA 合成

本研究提取的橡膠樹(shù)膠乳總RNA 的OD/OD 為2.10，OD/OD 為1.88，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A 所示，呈現(xiàn)2 條相對(duì)集中的亮帶，帶型完整，邊緣清晰，說(shuō)明RNA 樣品的完整性好。分離的mRNA 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（圖1B）電泳顯示呈彌散狀分布，條帶分布均勻，紫外分光光度測(cè)定總量為6.5 μg，OD/OD 為1.91，表明分離的mRNA 總量及純度滿足建庫(kù)要求。取5 μg mRNA 合成cDNA 第二鏈，進(jìn)行均一化處理后直接用于cDNA 文庫(kù)的制備。

2.2 cDNA 文庫(kù)制備、質(zhì)量檢測(cè)及質(zhì)粒提取

構(gòu)建的重組產(chǎn)物經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，稀釋100 倍細(xì)菌培養(yǎng)物的LB 平板共長(zhǎng)了約266 個(gè)克隆子，稀釋1000 倍的LB 平板共長(zhǎng)了約32 個(gè)克隆子，稀釋1000 倍的LB 平板共長(zhǎng)了3 個(gè)克隆子（圖2），經(jīng)計(jì)算其原始cDNA 文庫(kù)的滴度約為3.0×10CFU/mL，總庫(kù)容為1.5×10 CFU，符合篩庫(kù)要求。通過(guò)PCR 鑒定制備的cDNA 文庫(kù)插入片段多數(shù)介于1000～4000 bp 之間（圖3），平均插入片段長(zhǎng)度約為1500 bp，重組率為100%。將上述經(jīng)檢測(cè)的cDNA 文庫(kù)涂布于500 個(gè)35 cmLB 平板，經(jīng)培養(yǎng)、洗脫及質(zhì)粒提取后獲得庫(kù)容大于1.0×10 CFU/mL 的文庫(kù)質(zhì)粒，用于下一步的篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體的構(gòu)建

瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示，PCR 擴(kuò)增HbSRPP7 的ORF 片段大小正確（圖4），構(gòu)建的誘餌載體經(jīng)內(nèi)切酶檢測(cè)與預(yù)計(jì)相符（圖5）。測(cè)序結(jié)果顯示，目的片段正確插入pBT3STE 及pBT3STE 載體的Sfi Ι 位點(diǎn)中，且序列無(wú)移碼及堿基突變現(xiàn)象，說(shuō)明誘餌載體pBT3STE-SRPP7 和pBT3STE-SRPP7 構(gòu)建成功。

2.4 誘餌載體的自激活檢測(cè)及功能檢測(cè)

自激活及功能檢測(cè)結(jié)果顯示（表2），陽(yáng)性對(duì)照（反應(yīng)1）在SD/-Trp/-Leu（SD-TL）、SD/-Trp/-Leu/-His （ SD-TLH ） 及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（SD-TLHA）篩選平板上生長(zhǎng)旺盛，陰性對(duì)照（反應(yīng)2）在SD-TL 篩選平板上生長(zhǎng)正常，在SD-TLH和SD-TLHA 篩選平板上無(wú)生長(zhǎng)，與預(yù)計(jì)相符合，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系對(duì)照成立。而自激活檢測(cè)的反應(yīng)3和反應(yīng)4 在SD-TL 篩選平板上生長(zhǎng)正常，在SD-TLH 和SD-TLHA 篩選平板上無(wú)生長(zhǎng)，說(shuō)明pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 誘餌載體對(duì)NMY32 酵母無(wú)自激活活性。功能檢測(cè)的反應(yīng)5和反應(yīng)6 在SD-TLH 和SD-TLHA 篩選平板上有生長(zhǎng)，相對(duì)于SD-TL 篩選平板生長(zhǎng)率在35%～61%之間，顯示pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7均可在酵母中正常表達(dá)，皆可應(yīng)用于下一步的篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)，pBT3STE-SRPP7 的相對(duì)生長(zhǎng)率（60.7%和44.3%）較pBT3SUC-SRPP7（58.5%和35.8%）高，說(shuō)明pBT3STE-SRPP7 誘餌載體表達(dá)功能相對(duì)更強(qiáng)，因此后續(xù)篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)選用pBT3 STE-SRPP7誘餌載體進(jìn)行。

2.5 HbSRPP7 的互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

文庫(kù)篩選共獲得34 個(gè)可激活A(yù)DE2 和HIS3報(bào)告基因的初始陽(yáng)性克?。▓D6A）。LacZ 報(bào)告基因激活檢測(cè)顯示這34 個(gè)初始陽(yáng)性克隆的β-半乳糖甘酶活性（OD/OD）值皆大于陰性對(duì)照值（ 圖6B ）， 表明這些初始陽(yáng)性克隆均是與HbSR-PP7 存在相互作用的陽(yáng)性克隆。初始陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA 經(jīng)測(cè)序及Blastn 比對(duì)，結(jié)果顯示這34 個(gè)陽(yáng)性克隆包含21 種不同編碼的基因（表3）。進(jìn)一步的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，全部陽(yáng)性克隆均能通過(guò)對(duì)ADE2 和HIS3 報(bào)告基因激活的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，但其中2、3、8、12、23、26、29 和30 號(hào)陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)較弱（圖7A）且β-半乳糖甘酶活性值較低（圖7B），表明這些克隆所包含的相關(guān)蛋白與HbSRPP7 間存在的蛋白相互作用可能比較弱。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是目前最經(jīng)典的蛋白間相互作用研究方法，具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)[13]。但傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)僅限于相互作用發(fā)生于細(xì)胞核中的2 個(gè)或者幾個(gè)可溶性蛋白的互作分析，并不能對(duì)相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的膜蛋白或可溶蛋白進(jìn)行研究。MYTH 系統(tǒng)是傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的一種替代方法，無(wú)需核定位信號(hào)，主要依賴泛素降解途徑作為蛋白質(zhì)相互作用“感應(yīng)器”，對(duì)膜蛋白與膜蛋白、膜蛋白與可溶性蛋白之間相互作用進(jìn)行研究[14-16]，并且可以檢測(cè)3 個(gè)蛋白之間“橋接”的相互作用[7]。此外，因?yàn)闄z測(cè)的誘餌和獵物蛋白之間相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，所以可以與傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)相互補(bǔ)充，分析更多的互作目標(biāo)蛋白[17-19]。橡膠生物合成發(fā)生于乳管細(xì)胞中的橡膠粒子表面[20-21]。SRPP 家族蛋白是主要存在于橡膠粒子上的高豐度蛋白質(zhì)之一[22]，其蛋白相互作用并非發(fā)生于細(xì)胞核中，使用MYTH系統(tǒng)，可更有效篩選HbSRPP7 的互作蛋白。

MYTH 系統(tǒng)與傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)類似，均存在假陽(yáng)性率較高的缺點(diǎn)。誘餌蛋白在宿主酵母菌中的自激活活性是造成篩選結(jié)果假陽(yáng)性的重要原因之一[23]。本研究所用MYTH 系統(tǒng)誘餌蛋白自激活常見(jiàn)的表現(xiàn)是NMY32 中表達(dá)的誘餌（bait）融合蛋白和任意獵物（prey）載體（NubG）結(jié)合啟動(dòng)下游的轉(zhuǎn)錄[24]。需要比對(duì)陽(yáng)性對(duì)照或進(jìn)一步通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑3-AT（3-Aminotriazole， 3-氨基三唑）抑制較為輕微的自激活活性，降低干擾背景。此外，誘餌蛋白的正確翻譯與定位是本研究所使用MYTH 系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的前提。因此為保證后續(xù)利用MYTH 系統(tǒng)篩選HbSRPP7 的互作蛋白獲得較為可靠結(jié)果，在文庫(kù)篩選前，本課題組對(duì)誘餌載體的自激活活性以及在酵母中表達(dá)的誘餌蛋白功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示所構(gòu)建誘餌載體pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 在NMY32 酵母中均不存在自激活現(xiàn)象，排除誘餌蛋白自激活活性對(duì)篩選結(jié)果的干擾。同時(shí)功能檢測(cè)顯示pBT3STE-SRPP7 和pBT3SUC-SRPP7 均在NMY32酵母中有功能，確認(rèn)誘餌蛋白能在NMY32 酵母中正確表達(dá)。

本研究利用表達(dá)功能相對(duì)更強(qiáng)的pBT3STESRPP7誘餌載體對(duì)構(gòu)建的MYTH cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，并通過(guò)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證最終獲得21 個(gè)候選的HbSRPP7 互作蛋白。在這21 個(gè)候選互作蛋白中，有3 個(gè)REF 家族蛋白及2 個(gè)SRPP 家族蛋白。其中HbREF1（XM_021797910.1）及HbSRPP1（XM_021797905.1）已被證實(shí)與橡膠粒子發(fā)育相關(guān)[11， 21， 25-27]，并通過(guò)與CPT 蛋白直接或間接互作參與橡膠生物合成[7-8]。顯示HbSRPP7 可能通過(guò)與HbREF1 及HbSRPP1 等橡膠粒子互作，在橡膠粒子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，或者作為橡膠生物合成相關(guān)蛋白復(fù)合體的組分之一參與橡膠生物合成。此外，HbSRPP7 候選互作蛋白中有2 個(gè)活性氧清除相關(guān)蛋白（thioredoxin H-type-like、L-ascorbateperoxidase 2）[28-29]和5 個(gè)脅迫相關(guān)蛋白（highmobility group B protein 2-like、RPM1- interactingprotein 4-like、stress-related protein-like、salt stressinducedhydrophobic peptide ESI3-like、F-box/kelch-repeat protein）[30-34]，表明HbSRPP7 可能通過(guò)蛋白互作參與橡膠樹(shù)乳管生物和非生物逆境脅迫的響應(yīng)。橡膠樹(shù)的膠乳是一種與生物和非生物逆境脅迫的響應(yīng)關(guān)聯(lián)的保護(hù)物質(zhì)，割膠可以顯著促進(jìn)膠乳中的橡膠生物合成[ 3 5 ] 。因此，HbSRPP7 除了可能通過(guò)與橡膠生物合成相關(guān)的橡膠粒子蛋白互作參與橡膠生物合成，也可能通過(guò)與生物和非生物逆境脅迫相關(guān)蛋白互作，響應(yīng)橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞生物和非生物逆境脅迫系統(tǒng)信號(hào)，參與橡膠粒子上的橡膠生物合成調(diào)控。HbSRPP7與這些蛋白的相互作用在橡膠粒子上的具體功能尚有待確認(rèn)，下一步以免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）及雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（bimolecular fluorescence complementation， BiFC）鑒定互作蛋白，并通過(guò)橡膠體外合成實(shí)驗(yàn)及反向遺傳學(xué)研究手段對(duì)HbSRPP7 及其互作蛋白進(jìn)行功能研究，將有助于了解HbSRPP7 的功能及其功能發(fā)揮的機(jī)制，揭示橡膠粒子上參與橡膠生物合成的蛋白復(fù)合體組成，闡明橡膠生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制。