翁夢(mèng)婷，張 迪，羅貝貝，王宏雨，馬 璐，林衍銓

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 有 “陽光蘑菇”的美譽(yù)，是一種可人工栽培的食（藥） 用菌[1-2]。其口感脆嫩，深受廣大消費(fèi)者喜愛[3]。因子實(shí)體中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和多種活性成分，在增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗炎、抗衰老等方面具有顯著功效[4-6]。近年來，廣葉繡球菌栽培原料價(jià)格持續(xù)上漲，生產(chǎn)成本逐漸提高，但銷售價(jià)格卻不增反降。因此，對(duì)現(xiàn)有栽培配方進(jìn)行優(yōu)化是實(shí)際生產(chǎn)中亟待解決的問題之一。

食用菌栽培過程中，基質(zhì)中的碳氮含量及添加比例顯著影響子實(shí)體的生長發(fā)育，尤其是氮源，不僅影響食用菌的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量，也會(huì)使其營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的變化[7-9]。以2%的麥麩或6%的玉米粉為氮源栽培毛木耳（Auricularia cornea），產(chǎn)量最高，經(jīng)濟(jì)效益較佳[10]。采用熟料栽培糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus），以玉米芯作為栽培主料、麥麩作為輔料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)料含氮量為1.69%且碳氮比為21.09 ∶1.00 的配方栽培效果最佳[8]。采用碳酸氫銨、硫酸銨和尿素3 種無機(jī)氮源栽培姬松茸（Agaricus blazei） 時(shí)，發(fā)現(xiàn)以碳酸氫銨為氮源時(shí)姬松茸產(chǎn)量最高，且子實(shí)體中17 種氨基酸含量及各類氨基酸總量均最優(yōu)[11]。硫酸銨、尿素、麩皮和牛糞4種不同氮源栽培虎奶菇（Pleurotus tuber-regium Sing.） 時(shí)，以尿素為氮源栽培的虎奶菇營養(yǎng)成分比值系數(shù)最高[12]。

目前的研究多集中于不同碳氮比的基質(zhì)對(duì)廣葉繡球菌菌絲和子實(shí)體生長發(fā)育的影響，以及子實(shí)體和菌絲體的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[13-14]；但未涉及基質(zhì)含氮量與子實(shí)體所含營養(yǎng)物質(zhì)、活性成分的關(guān)系。為此，通過配制不同含氮量的栽培基質(zhì)，分析含氮量對(duì)廣葉繡球菌產(chǎn)量、主要營養(yǎng)成分和活性成分的影響，為廣葉繡球菌栽培配方的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試廣葉繡球菌菌種由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 主要儀器

Pilot3-6L 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UPT-II-20T 超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；Centrifuge 5804-R 離心機(jī)，德國艾本德公司；HPLC-PDA 高效液相色譜儀，美國沃特世有限公司。

1.3 栽培配方及其含氮量測(cè)定

以70%的松木屑為主料，不同含量的馬鈴薯淀粉和玉米粉為輔料，設(shè)置6 個(gè)配方，采用凱氏定氮法測(cè)定氮含量。結(jié)果詳見表1。

表1 不同栽培配方Tab.1 Different cultivating formulas

按照表1 所示的配方制備栽培基質(zhì)，加入水混勻，栽培基質(zhì)最終含水量為60%～65%。采用聚丙烯塑料袋（33 cm × 17 cm × 0.005 cm） 裝袋，每個(gè)配方重復(fù)200 袋。中間預(yù)留接種孔，每袋裝濕料800～850 g，126 ℃高壓滅菌150 min。待栽培袋冷卻后，接入廣葉繡球菌菌種，隨后在20～22 ℃條件下進(jìn)行菌絲培養(yǎng)。待原基形成且突起時(shí)進(jìn)行出菇培養(yǎng)，并計(jì)算90 d 內(nèi)達(dá)到開袋標(biāo)準(zhǔn)的菌袋數(shù)目。出菇培養(yǎng)溫度為16～20 ℃，空氣相對(duì)濕度為90%～95%。當(dāng)子實(shí)體瓣片展開、邊緣呈波浪形時(shí)即可采收。每個(gè)配方隨機(jī)選擇3～6 袋長勢(shì)良好的子實(shí)體，凍干、粉碎后測(cè)定蛋白質(zhì)、氨基酸、葡聚糖及麥角甾醇的含量。

1.4 蛋白質(zhì)和氨基酸含量測(cè)定

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2016）[15]測(cè)定蛋白質(zhì)含量；根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸含量的測(cè)定》（GB 5009.124-2016）[16]測(cè)定氨基酸含量。

1.5 總葡聚糖、α-葡聚糖和β-葡聚糖含量的測(cè)定

采用Megazyme 的β-glucan Assay kit （Yeast &Mushroom） 試劑盒，按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

堅(jiān)持早中晚三巡塘制度，尤其是臺(tái)風(fēng)、暴雨、連續(xù)陰雨等極端天氣，更應(yīng)全天候堅(jiān)持巡塘，觀察魚池水質(zhì)變化及魚的活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)采取處置措施。通常采用的魚病防治方法有潑灑法、懸掛法和內(nèi)服法。堅(jiān)持定期潑灑藥物，按時(shí)掛簍掛袋，間隔投喂藥餌，防治結(jié)合，嚴(yán)格管控，堅(jiān)決杜絕病害發(fā)生。一般每間隔15～20d，全池潑灑氯制劑一次，魚病高發(fā)時(shí)期每間隔15d用出血寧、五黃粉等藥物拌餌或制成藥餌投喂，用量一般為投餌量的0.5%左右。同時(shí)打掃好池塘衛(wèi)生，及時(shí)清除殘餌及池中雜物，漁具使用后應(yīng)放在陽光下曝曬，并藥浴消毒，保持池塘環(huán)境衛(wèi)生，消除治病因子。

1.6 麥角甾醇含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配置200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。采用HPLCPDA 法測(cè)定麥角甾醇含量。

HPLC-PDA 測(cè)定方法：液相色譜柱為Waters SunFire C18 柱（4.6 nm × 250 nm，5 μm），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速1 mL·min-1，流動(dòng)相為100%甲醇，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Graphpad prism 8.0 軟件繪圖。P＜0.05 的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體形成的影響

試驗(yàn)中各供試配方均可正常出菇，但廣葉繡球菌子實(shí)體的形成存在差異，詳見圖1。

圖1 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體形成的影響Fig.1 Effects of nitrogen content of substrate on fruiting rate of Sparassis latifolia

如圖1 所示，隨著基質(zhì)中含氮量的增加，廣葉繡球菌90 d 內(nèi)子實(shí)體形成率呈先上升后下降的趨勢(shì)?；|(zhì)含氮量為0.25%時(shí)，90 d 內(nèi)子實(shí)體形成率最高，達(dá)94%；隨后子實(shí)體的形成率逐漸降低，當(dāng)基質(zhì)含氮量為0.43%時(shí)子實(shí)體形成率降低到30%，說明相比之下配方6 不適宜用于生產(chǎn)。

2.2 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌產(chǎn)量的影響

對(duì)采收后的鮮菇按照商品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修剪，隨后統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組的平均袋產(chǎn)量，結(jié)果詳見圖2。

圖2 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of nitrogen content of substrate on yield of Sparassis latifolia

如圖2 所示，隨著基質(zhì)中含氮量的增高，鮮菇的平均袋產(chǎn)量也逐漸升高。在供試范圍內(nèi)，配方1～6 的平均袋產(chǎn)量分別為112.86、129.64、163.93、188.16、198.20 和208.52 g。以配方6 （含氮量0.43%） 平均袋產(chǎn)量最高，比配方1 （含氮量0.13%）升高了84.76%；與配方4 和配方5 的平均袋產(chǎn)量無顯著性差異。可見，基質(zhì)含氮量可影響廣葉繡球菌子實(shí)體的產(chǎn)量，提高基質(zhì)含氮量可使其產(chǎn)量升高。

2.3 基質(zhì)的含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體蛋白質(zhì)含量的影響

不同配方中子實(shí)體蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果詳見圖3。

圖3 不同配方下廣葉繡球菌的蛋白質(zhì)含量Fig.3 Protein content of Sparassis latifolia in different formulas

如圖3 所示，隨著基質(zhì)中含氮量的增加，廣葉繡球菌子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，達(dá)到一定量后不再增加。配方5 中子實(shí)體的蛋白質(zhì)含量最高，為17 g·100-1·g-1。配方6 中子實(shí)體的蛋白質(zhì)含量與配方5 無顯著性差異。

2.4 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體氨基酸含量的影響

各供試配方栽培的廣葉繡球菌子實(shí)體中均檢測(cè)到17 種氨基酸，各組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見圖4。

圖4 不同配方下廣葉繡球菌瓣片的氨基酸總量Fig.4 Total amino acids content of Sparassis latifolia flabella in different formulas

如圖4 所示，隨著基質(zhì)中含氮量的增加，子實(shí)體中氨基酸總量及各種氨基酸含量均呈上升趨勢(shì)，達(dá)到一定量后不再增加。配方5 中子實(shí)體所含的氨基酸總量最高（14.68 g·100-1·g-1），比配方1 高88.21%。配方1～4 中，子實(shí)體的氨基酸含量排名前三的依次是谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甲硫氨酸（Met）。采用配方5 和配方6 時(shí)，子實(shí)體的氨基酸含量排名前三的依次是谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸（Leu）。

各供試配方栽培的子實(shí)體中，必需氨基酸所占比例的統(tǒng)計(jì)情況詳見表2，鮮味氨基酸所占比例的統(tǒng)計(jì)情況詳見表3，表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。

表2 必需氨基酸占氨基酸總量百分比Tab.2 Percentage of essential amino acids in total amino acids

表3 鮮味氨基酸占氨基酸總量百分比Tab.3 Percentage of tasty amino acids in total amino acids

如表2 和表3 所示，子實(shí)體中所含的必需氨基酸總量均在40%以上。其中配方2 中子實(shí)體所含的必需氨基酸總量最高，達(dá)到42.02%，但與配方1、3、5 間無顯著性差異。隨著基質(zhì)中含氮量的增加，蘇氨酸和甲硫氨酸占氨基酸總量的百分比逐漸降低。配方1 中甲硫氨酸所占比例比配方6 高30.55%。而纈氨酸、異亮氨酸及亮氨酸3 種氨基酸所占比例無顯著性差異。說明基質(zhì)含氮量對(duì)瓣片中部分氨基酸含量有影響。各供試配方中4 種鮮味氨基酸總含量在37%～40%；其中，對(duì)鮮味有特征性影響的谷氨酸和天冬氨酸，其含量之和均超過25%。

2.5 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體葡聚糖含量的影響

不同配方中，廣葉繡球菌子實(shí)體中總葡聚糖、α-葡聚糖，β-葡聚糖的含量統(tǒng)計(jì)情況詳見圖5。

圖5 不同配方廣葉繡球菌子實(shí)體中葡聚糖含量Fig.5 Glucan content of Sparassis latifolia fruit body in different formulas

如圖5 所示，各供試配方中總葡聚糖和β-葡聚糖的含量無顯著性差異。β-葡聚糖含量幾乎均在40%以上。說明基質(zhì)中添加不同比例的玉米粉和馬鈴薯淀粉，對(duì)子實(shí)體中總葡聚糖和β-葡聚糖含量的影響較小。在供試范圍內(nèi)，玉米粉添加量達(dá)到24%時(shí)，子實(shí)體中α-葡聚糖的含量高于其他配方，達(dá)到15.79%。

2.6 基質(zhì)含氮量對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體中麥角甾醇含量的影響

不同配方中，廣葉繡球菌子實(shí)體中麥角甾醇的含量情況詳見圖6。

圖6 不同配方下廣葉繡球菌瓣片中麥角甾醇含量Fig.6 Ergosterol content of Sparassis latifolia flabella in different formulas

如圖6 所示，不同配方條件下子實(shí)體中麥角甾醇的含量無顯著性差異。配方1 和配方4 中含量相對(duì)較高，分別為4.61 mg·g-1和4.56 mg·g-1。說明不同比例的玉米粉和馬鈴薯淀粉對(duì)麥角甾醇含量影響較小。

3 結(jié)論與討論

食用菌從環(huán)境中吸收的氮是合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)不可或缺的原料[17]。氮含量顯著影響食用菌的產(chǎn)量，因此提高基質(zhì)中的含氮量能達(dá)到增產(chǎn)的目的[18-19]?；|(zhì)含氮量低時(shí)，食用菌會(huì)將少量的氮利用于主要代謝過程，其他生理活動(dòng)則會(huì)受到影響，導(dǎo)致菌絲生長和子實(shí)體分化緩慢[20]?；|(zhì)含氮量過高時(shí)會(huì)影響活性氧代謝，由于抗氧化酶的活性降低，使得活性氧過度累積，增加脂質(zhì)過氧化，從而引起顯著的代謝變化[21]。因此基質(zhì)中適宜的含氮量是提高食用菌產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。廣葉繡球菌具有“高碳低氮”的營養(yǎng)生理特性[13]。試驗(yàn)利用不同含氮量的基質(zhì)栽培廣葉繡球菌，以分析基質(zhì)含氮量對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成等方面的影響。結(jié)果表明，當(dāng)基質(zhì)含氮量從0.13%升高到0.43%時(shí)，廣葉繡球菌平均產(chǎn)量也逐漸升高，但氮含量過高對(duì)子實(shí)體發(fā)育不利，這可能是配方6 中子實(shí)體形成率低的原因。

不同氮源及其含氮量會(huì)造成子實(shí)體營養(yǎng)成分的差異。例如，在栽培基質(zhì)中添加不同比例的豆粕作為白背毛木耳[Auricularia polytricha （Mout.） Sacc.]的有效氮源，可顯著提高蛋白質(zhì)、氨基酸和粗纖維的含量，其中豆粕添加量為5%時(shí)栽培效果最佳[22]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著基質(zhì)中含氮量的升高，蛋白質(zhì)含量也逐漸增加；當(dāng)含氮量超過0.37%后，蛋白質(zhì)含量不再增加。這與張波等[10]關(guān)于毛木耳的研究結(jié)果類似，麥麩和玉米粉2 種氮源添加量達(dá)到一定值后，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值，再繼續(xù)增加氮源，蛋白質(zhì)含量反而降低。同樣的，氨基酸總量也隨著基質(zhì)中氮含量的升高而逐漸增加，當(dāng)?shù)砍^0.37%后，氨基酸總量不再增加。不同配方中必需氨基酸均占氨基酸總量的40%以上，與菌渣培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 的情況相似[23]。谷氨酸和天冬氨酸是重要的呈鮮味氨基酸，試驗(yàn)中這2 種氨基酸的含量之和均超過氨基酸總量的25%，這可能是廣葉繡球菌味道鮮美的重要原因[24]。

不同氮源及含氮量會(huì)影響食用菌菌絲和子實(shí)體中重要活性成分、次生代謝物的累積[25-26]。平菇（Pleurotus ostreatus） 的栽培基質(zhì)中添加尿素或米糠，能有效提高子實(shí)體中β-葡聚糖的含量[27]。桑黃（Phellinus igniarius） 菌絲培養(yǎng)過程中，以碳酸銨為氮源，且碳氮比為80 ∶1 時(shí)有利于黃酮、多酚和甾醇的累積[28]。試驗(yàn)中分析了不同含氮量的基質(zhì)對(duì)廣葉繡球菌子實(shí)體中β-葡聚糖含量的影響，結(jié)果表明各配方間無顯著性差異。同樣的，采用不同的栽培基質(zhì)，各配方間子實(shí)體中麥角甾醇的含量亦無顯著性差異。因此，后續(xù)試驗(yàn)可對(duì)廣葉繡球菌活性成分有顯著影響的氮源及其含氮量進(jìn)行進(jìn)一步挖掘。