姚春馨，王小艷，王小蓉，田果廷**

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205；2.陸良爨鄉(xiāng)綠圓菇業(yè)有限公司，云南 曲靖 655600）

甘藍(lán)色膜褶菌[Hymenopellis raphanipes （Berk.）R.H.Petersen]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 膜褶菌屬（Hymenopellis）[1]，同物異名為卵孢小奧德蘑（Oudemansiella raphanipes），又名長根菇，別名有露水雞址樅、黑皮雞址樅、紅土雞址樅等[2]。甘藍(lán)色膜褶菌富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、微量元素以及真菌多糖、三萜類、樸菇素、生物堿、牛磺酸、葉酸等[3-5]，其活性成分具有降血壓、促進(jìn)人體細(xì)胞生長等功效[6-7]。其形態(tài)、口感、品質(zhì)及食用方法與蟻巢傘屬雞址樅菌（Termitomyces albuminosus） 相似，是一類具較高營養(yǎng)、藥用及經(jīng)濟(jì)價值的特色珍稀食用菌，野生子實體價格較高。

長根菇作為我國近年來市場熱銷的種類，是商業(yè)化栽培的熱點特色菌類，發(fā)展前景好，生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)量上升較快。但目前適宜各地栽培生產(chǎn)的優(yōu)良品種極少，國內(nèi)中文檢索結(jié)果僅有 “露水雞址樅”（川審菌2003009） 1 種[8]。而市場流通的其他栽培菌株良莠不齊，多數(shù)菌株栽培周期長、抗性差，導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定，品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)效益不佳[9]，嚴(yán)重制約了長根菇的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。針對新品種匱乏、優(yōu)良菌種繁育和規(guī)?；耘嗉夹g(shù)不規(guī)范等行業(yè)痛點問題，研究發(fā)掘并系統(tǒng)選育了系列特色新品種。

1 材料與試劑

1.1 供試菌株

供試菌株信息見表1。

表1 供試菌株信息Tab.1 Information of test strains

由表1 所示，項目組依托云南豐富的野生食用菌資源，于2009 年開始進(jìn)行長根菇野生菌株的收集與評價[10-11]，按照《食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范》（GB/T 21125-2007）[12]進(jìn)行選育，2011 年至2016 年進(jìn)行菌株分離和鑒定，以露水雞址樅為對照，2017 年至2020年開展出菇試驗、品比試驗，期間進(jìn)行分子鑒定、抗性鑒定和品質(zhì)分析。

1.2 培養(yǎng)基配方

YPD 固體培養(yǎng)基配方：酵母膏10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1，pH 自然，進(jìn)行菌絲培養(yǎng)時采用25 ℃，暗培養(yǎng)。

菌種栽培培養(yǎng)基配方：闊葉樹雜木屑52%、玉米芯35%、麩皮10%、豆粕2%、石膏粉1%，含水量60%～65%；可按當(dāng)?shù)剞r(nóng)林廢料適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)料配方，但需確保含有50%以上富含木質(zhì)素的雜木屑。

1.3 試驗試劑與儀器

試驗所用擎科金牌Mix （green） PCR 試劑，南京諾唯贊生物科技有限公司；Fungal gDNA Isolation Kit DNA 提取試劑盒，拜爾迪生物技術(shù)有限公司（Biomiga）；Gel Extraction Kit/D2500-02 膠回收試劑盒，美國Omega Bio-Tek 公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR 引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測序由擎科生物（昆明） 完成。

MLS-2420 高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋（Sanyo）公司；DHP-600BS 培養(yǎng)箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；SW-CJ-IF 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SZX16 顯微鏡，日本奧林巴斯（Olympus） 公司；80i 顯微鏡，日本尼康（Nikon） 公司；各規(guī)格移液槍，艾本德（eppendorf） 公司。

2 試驗方法

2.1 分子生物學(xué)鑒定

將6 個供試菌株轉(zhuǎn)接入YPD 培養(yǎng)皿中，25 ℃暗培養(yǎng)6～8 d，直至菌絲長滿。刮取菌絲，液氮研磨，用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。經(jīng)電泳檢測合格后，采用真菌ITS 通用引物（ITS1/5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′，ITS4/5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′） 對供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增。

擴(kuò)增產(chǎn)物，雙向測序并進(jìn)行拼接處理，在Gen－Bank 上進(jìn)行BLAST 比對。用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行ITS 序列最大相似法分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 栽培試驗

栽培方式：采用項目組前期研究總結(jié)的栽培技術(shù)[10]，即熟料袋栽覆土出菇模式，使用通用聚乙烯塑料袋（16 cm×35 cm×0.05 mm），每袋裝干料550 g，每袋濕料質(zhì)量為1 200 g。

2.2.1 品比試驗

2018 年在石林縣板橋食用菌試驗基地進(jìn)行品種比較試驗，11 月至翌年2 月接種發(fā)菌管理，2 月開始進(jìn)行出菇管理，6 月開始采收。設(shè)置5 個供試菌株組與1 個對照組，每組200 個菌棒，設(shè)3 次重復(fù)。

2.2.2 區(qū)域試驗

2019 年至2020 年，對品比試驗篩選獲得的優(yōu)良菌株進(jìn)行區(qū)域栽培試驗，在昆明市盤龍區(qū)、官渡區(qū)、石林縣和東川區(qū)，德宏州芒市、隆陽食（藥）用菌產(chǎn)區(qū)6 個試驗點進(jìn)行。每個菌種1 000 個菌棒，累計栽培規(guī)模超過4.4 萬個菌棒。同時，按照《農(nóng)作物品種審定規(guī)范食用菌》 （NY/T 1844-2010）[13]的方法開展2 年的抗性鑒定。

2.2.3 生產(chǎn)試驗

2021 年至2022 年，在德宏州芒市、昆明市石林縣進(jìn)行優(yōu)良菌株的生產(chǎn)試驗。每個試驗點各供試菌種栽培5 000 個菌棒，2 個試驗點共計栽培規(guī)模超過8 萬菌棒。

2.3 品質(zhì)分析

將生產(chǎn)試驗采收后的新鮮子實體樣品送中華全國供銷合作總社昆明食用菌質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進(jìn)行主要成分檢測。

3 選育結(jié)果

3.1 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

通過rDNA-ITS 序列比對法和ITS 序列最大相似法分析，以香菇（Lentinula edodas） 為外類群，各供試菌株和對照菌珠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖1。

圖1 6 個長根菇菌株及近似種的ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of six Hymenopellis raphanipes and related species based on ITS sequences

如圖1 所示，長根菇供試菌株與Hymeno pellis raphanipes （KX688240.1） ITS 序列同源性極高，相似度為99%以上，且與對照CK 及外緣物種均有一定的遺傳距離，因此，將新品種YJZ01、YJZ04 和YJZ05 均鑒定為膜褶菌屬甘藍(lán)色膜褶菌（H.raphanipes）。

3.2 栽培試驗結(jié)果

3.2.1 品比試驗結(jié)果

5 個供試菌株的品比試驗結(jié)果見表2。

表2 5 個供試菌株品比試驗結(jié)果Tab.2 Comparison experiment results of five test strains

由表2 結(jié)果顯示，5 個新菌株出菇期均短于對照，特別是YJZ05 菌株出菇期比CK 縮短24 d；5 個新菌株鮮菇產(chǎn)量均比對照增加。篩選得到3 個優(yōu)良菌株綜合產(chǎn)量等因素，菌株YJZ01 比CK 增產(chǎn)28.57%，YJZ04 菌株增產(chǎn)32.40%，YJZ05 菌株增產(chǎn)35.53%；生物學(xué)效率相比對照也有大幅提高。

3.2.2 區(qū)域試驗

經(jīng)品比試驗篩選得到3 個長根菇優(yōu)良菌株的區(qū)域試驗產(chǎn)量比較見表3。

表3 3 個供試菌株區(qū)域試驗產(chǎn)量比較Tab.3 Yield companison of three test strains in regional experiment

由表3 結(jié)果表明，在高海拔地區(qū)盤龍區(qū)阿子營（海拔2 300 m），4 個供試菌株鮮菇產(chǎn)量僅達(dá)140～160 g/袋，產(chǎn)量較低，均不適宜在高海拔地區(qū)栽培生產(chǎn)。在海拔1 000 ～2 000 m 地區(qū)，菌株YJZ01、YJZ05 產(chǎn)量高于360 g/袋，特別是YJZ05 菌株，與其他菌株相比，在中高海拔地區(qū)的官渡區(qū)、石林縣和東川區(qū)產(chǎn)量均最高，分別比對照增產(chǎn)44.12%、32.99%、33.11%；在海拔1 700 m 以下地區(qū)，YJZ04菌株的產(chǎn)量表現(xiàn)更好，比對照增產(chǎn)24.00%～40.57%。

3.2.3 生產(chǎn)試驗結(jié)果

3 個優(yōu)良長根菇菌株的生產(chǎn)試驗結(jié)果見表4。

表4 3 個供試菌珠生產(chǎn)試驗產(chǎn)量比較Tab.4 Yield comparison of three test strains in production experiment

由表4 可知，生產(chǎn)試驗中新選育菌株YJZ01、YJZ04 和YJZ05 平均鮮菇產(chǎn)量分別為372 g/袋、386 g/袋與395 g/袋，比對照相比平均增產(chǎn)28.28%、33.10%與36.21%，產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)的是在芒市生產(chǎn)試驗的YJZ04 菌株及石林試驗生產(chǎn)的YJZ05 菌株。

3.3 新品種特性分析結(jié)果

以露水雞址樅為對照，在海拔700～2 300 m 的6個試驗示范基地進(jìn)行多年示范栽培，選育了出菇整齊、性狀穩(wěn)定、產(chǎn)量高、商品性好的3 個菌株，屬中高溫型長根菇品種，其子實體形態(tài)見圖2。

圖2 3 個長根菇新品種子實體Fig.2 Fruit bodies of three new cultivars of Hymenopellis raphanipes

3 個新品種于2022 年獲得云南省非主要農(nóng)作物品種鑒定證書，分別定名為 “云雞址樅1 號”（YJZ01）[滇鑒(食用菌) 2022131 號]、“云雞址樅4 號”（YJZ04）[滇鑒(食用菌) 2022133 號] 和“云雞址樅5 號”（YJZ05）[滇鑒(食用菌) 2022134 號]。

3.3.1 形態(tài)特征

3 個長根菇新品種菌絲均呈白色絨毛狀，具鎖狀聯(lián)合和分枝分隔，菌落苔面整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)。僅YJZ04 菌株在菌絲老熟后分泌色素，產(chǎn)生暗褐色菌皮。3 個新品種的子實體形態(tài)特征描述見表5。

表5 長根菇新品種形態(tài)特征比較Tab.5 Morphology comparison of the new cultivars of Hymenopleeis raphanipes

如表5 所示，3 個新品種的子實體特征差異顯著。

3.3.2 抗性比較

3 個長根菇菌株的抗性鑒定比較見表6。

表6 新品種抗性鑒定Tab.6 Resistance identification of new cultivars

如表6 所示，新品種在整個栽培生產(chǎn)期內(nèi)（包括菌絲培育、菌棒發(fā)菌、開袋、覆土出菇等時期），雜菌污染率低，與對照相比具有更強(qiáng)的抗雜性；在出菇管理期間，發(fā)病率均較低，具有較好的抗病性。

3.3.3 品質(zhì)比較

新品種品質(zhì)優(yōu)，具有良好的食用口感和較高的營養(yǎng)價值。與對照相比，YJZ01 菌株蛋白質(zhì)增加14.04%，脂肪降低66.67%，鋅增加12.63%，天然磷增加28.93%。YJZ04 菌株蛋白質(zhì)增加15.79%，鐵增加27.24%，鋅增加37.89%，纖維素增加42.31%，天然磷增加27.12%。YJZ05 菌株灰分比對照減少22.22%，脂肪降低5 倍，鐵增加20.23%，鋅增加30.53%，多糖增加11.11%，天然磷增加26.95%。新品種YJZ05 菌株在常規(guī)栽培條件下，其子實體干物質(zhì)有機(jī)硒含量達(dá)0.78 mg·kg-1，比對照增加83.10%，填補(bǔ)了國內(nèi)富硒長根菇品種的空白。

4 栽培技術(shù)要點總結(jié)

4.1 發(fā)菌管理

3 個品種菌絲適宜中性偏酸環(huán)境生長，最適pH 5.5～6.5。菌株YJZ01 和YJZ05 菌絲生長溫度10～35 ℃，而菌株YJZ04 可以適應(yīng)高溫15～37 ℃，最適溫度均為20～25 ℃?？刂瓢l(fā)菌室溫度為15～25 ℃，空氣相對濕度為40%～60%，通風(fēng)條件下暗培養(yǎng)，成熟后開袋覆土（壤土或者沙壤土，厚度3～5 cm），形成褐色斑駁菌皮或菌絲密集成束狀時出菇管理。

4.2 出菇管理

菌株YJZ01 子實體生長適宜溫度為20～30 ℃，菌株YJZ05 為18～28 ℃，具高溫耐性的菌株YJZ04則為20～35 ℃。出菇期間管理應(yīng)模擬其生境小環(huán)境，關(guān)鍵在于控制溫度、濕度和通風(fēng)。需特別注意菌株YJZ04 在菌絲生長旺盛期，菌包極易升溫，應(yīng)確保棚溫＜28 ℃。子實體發(fā)生后，空氣相對濕度控制在75%～90%，溫度控制在20～30 ℃，CO2濃度控制在0.3%。新品種屬變溫結(jié)實型菌類，早晚應(yīng)采用通風(fēng)、噴水等降溫措施，以8 ℃左右的溫差刺激催菌。

4.3 采收

按市場的需求，選擇開傘程度小和開傘程度中等的菇，小菇耐儲運，貨架期長，較適于鮮銷；大菇則適宜進(jìn)行加工。按品種特點采收：菌株YJZ01小菇形態(tài)圓整、質(zhì)地脆硬，耐儲運，貨架期長，適宜鮮銷，成熟后開傘大而肉厚，產(chǎn)量可觀，加工最佳；菌株YJZ04 菇形整齊，開傘慢，顏色深，口感脆嫩，耐包裝，貨架期長，宜冷鏈鮮銷；菌株YJZ05 菌柄色白、修長，菌蓋光滑、圓整，菌肉潔白細(xì)嫩，菇型挺拔，則更適宜整菇加工。

4.4 轉(zhuǎn)潮管理

采收后，應(yīng)及時清理表面覆土及殘留菇體，停水、保溫養(yǎng)菌5～10 d 后噴水，通過增濕、降溫、增光、促蕾，轉(zhuǎn)潮管理得當(dāng)可再采收5～7 潮。

4.5 病蟲害防治

病蟲害防治遵循預(yù)防為主，藥劑防治為輔的原則。長根菇病害較少，主要有霉菌、細(xì)菌和粘菌，注意無菌操作環(huán)節(jié)，防止栽培袋破損，提前做好土壤消毒并定期通風(fēng)換氣。蟲害主要發(fā)生在發(fā)菌期，做好覆土材料殺蟲預(yù)處理，宜選擇高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥。

5 結(jié)論與展望

針對長根菇品種缺乏、優(yōu)良菌種及配套栽培技術(shù)不足等行業(yè)瓶頸，項目組發(fā)掘云南野生食用菌資源，分別自大理州雞足山、普洱市錦屏鎮(zhèn)和保山市潞江壩采集野生長根菇菌株，經(jīng)組織分離、初篩、復(fù)篩，系統(tǒng)選育獲得的3 個特色新品種：云雞址樅1 號（YJZ01）、云雞址樅4 號（YJZ04） 和云雞址樅5 號（YJZ05），三者均為甘藍(lán)色膜褶菌（Hymenopellis raphanipes）。新品種具有特異性、一致性和穩(wěn)定性，與對照露水雞址樅相比，出菇期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)，屬中高溫型抗性品種。YJZ01、YJZ05 在海拔2 000 m以下地區(qū)栽培表現(xiàn)抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)，YJZ04 在海拔1 700 m 以下地區(qū)栽培耐熱性和抗性特征突出。新品種的選育極大的豐富了我國長根菇的優(yōu)良品種，保護(hù)和利用了云南高原特色野生菌優(yōu)質(zhì)資源，促進(jìn)了高原特色菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。