徐晨 孫婕 朱成容 闞鴻 董凱

1（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春130118）

2（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，長春 130012）

3（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，長春 130118）

磁共振成像（MRI）具有出眾的軟組織對比度，目前已經(jīng)成為臨床應(yīng)用中一種功能強大的診斷工具，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的非侵入性診斷。與其它成像方式相比，MRI 可以提供豐富的解剖學(xué)信息，并且不具有電離輻射，但其敏感性較低，因此臨床應(yīng)用磁共振進行診斷時通常需要借助造影劑突出特定感興趣區(qū)域（ROI）的解剖學(xué)和病理學(xué)特征。MRI 造影劑主要是通過縮短質(zhì)子的馳豫時間增強不同組織之間以及病變組織與其周圍正常組織之間信號強度的對比[1-2]。根據(jù)作用原理不同，MRI 造影劑可分為以釓（Gd）類化合物為主要研究對象的縱向弛豫型造影劑和以鐵類物質(zhì)為核心的橫向弛豫型造影劑[3-9]。目前，臨床應(yīng)用較廣泛的MRI 造影劑為Gd 螯合物，但有研究發(fā)現(xiàn)，潛在釋放的游離Gd3+可能引起生物體腎細胞的纖維化[10-11]。因此，需要開發(fā)高效和安全的新型MRI 造影劑。

隨著納米科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，研究者開發(fā)了眾多的釓基納米MRI 造影劑[12-24]。與傳統(tǒng)的小分子造影劑相比，納米造影劑因在單位單元中含有大量原子，能夠顯著增強成像效果。此外，可以對納米造影劑進行功能化修飾，延長其體內(nèi)循環(huán)時間，增加靶向性，提高生物相容性。盡管釓基納米造影劑在疾病診斷中的應(yīng)用取得了一定進展，但納米造影劑的安全性一直是研究者關(guān)注的重大課題。目前，關(guān)于稀土納米造影劑的生物安全性評價僅體現(xiàn)在對細胞分化、增殖以及存活率的研究以及常規(guī)的血液學(xué)和病理學(xué)方面，通常只能在宏觀層面上判斷對機體的組織器官是否有損害。然而，由于納米粒子獨特的理化性質(zhì)以及生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，納米粒子與機體之間的相互作用存在諸多不確定性，有些相互作用在生理生化水平很難被觀察和檢測到。因此，需要建立一種系統(tǒng)、高效、準(zhǔn)確和靈敏的檢測方法用于稀土納米造影劑的生物安全性評價。

代謝組學(xué)是通過考察生物體系受刺激或擾動（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化）后代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，用于研究生物體系代謝途徑的技術(shù)[25]。代謝組學(xué)融合了現(xiàn)代分析技術(shù)、生物信息學(xué)、化學(xué)計量學(xué)和統(tǒng)計學(xué)等方向，具有整體性和動態(tài)性的特點，是研究物質(zhì)和機體相互作用分子機制的優(yōu)良方法。近年來，研究者采用代謝組學(xué)的方法研究了納米粒子的生物安全性，以探究納米粒子對機體代謝途徑的影響，發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物，確定靶點，探索其毒性機制等[26-30]。但是，采用代謝組學(xué)方法對稀土納米造影劑生物安全性的研究目前尚未見報道。

本研究構(gòu)建了聚乙二醇（PEG）修飾的四氟化釓鈉（NaGdF4）納米粒子（PEG-NaGdF4）作為釓基納米造影劑，考察了不同劑量PEG-NaGdF4的MRI 成像能力，應(yīng)用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法對給予不同劑量的PEG-NaGdF4后的大鼠體內(nèi)代謝相關(guān)物質(zhì)變化進行了分析，確定PEG-NaGdF4納米造影劑對機體影響的潛在生物標(biāo)志物及代謝通路，并系統(tǒng)考察了機體代謝變化與PEG-NaGdF4劑量的相互關(guān)系。本研究結(jié)果表明，中劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑（50 μg/mL）對大鼠代謝的影響較小，說明其具有良好的生物安全性。本研究為評價稀土納米造影劑的生物安全性提供了新策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FEI Tecnai G2 F20 透射電子顯微鏡（荷蘭FEI 公司）；Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）；SDT-Q600 同步熱分析儀（美國Perkin Elmer 公司）；Philips Intera 1.5 T 磁共振成像系統(tǒng)（荷蘭Best 公司）；Waters Synapt G2 UPLC-ESI-QTOF/MS（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

聚乙二醇（PEG-2000）、乙二醇（EG）、GdCl36H2O、NH4F 和NaCl（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈和甲酸（色譜純，美國Fisher 公司）。其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PEG-NaGdF4的合成

稱取1.5 g PEG-2000，在攪拌下溶解于20 mL 乙二醇中，將GdCl3·6H2O（0.372 g）和NaCl（0.058 g）加入到上述溶液中，在攪拌下反應(yīng)30 min。將溶解有0.15 g NH4F 的乙二醇（10 mL）加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，反應(yīng)后的混合物移入水熱反應(yīng)釜中，在190 ℃反應(yīng)24 h。產(chǎn)物離心（10 min，12000 r/min），收集固體物質(zhì)，用水洗滌后再次離心，如此重復(fù)3～5 次，獲得的產(chǎn)物置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥。

1.2.2 MRI成像研究

采用生理鹽水配制0、6.25、12.5、25、50、100 和200 μg/mL 的PEG-NaGdF4納米造影劑溶液，置于MRI 系統(tǒng)對其進行掃描，評價其體外MRI 成像效果。為了評價PEG-NaGdF4納米造影劑的體內(nèi)MRI成像效果，首先將昆明小鼠麻醉，然后分別尾靜脈注射25、50 和100 μg/mL 的PEG-NaGdF4納米造影劑，在MRI 系統(tǒng)中采集注射前后10 min 的小鼠全身的MRI 圖像。MRI 成像參數(shù)為：7.62 cm（3 英寸）表面線圈；軸向T1FSE、SE 序列；重復(fù)時間TR=620 ms；回波時間TE=20.6 s；掃描視野FOV=200×200，層厚度=3.0 mm，無間隔。

1.2.3 代謝組學(xué)樣品收集與制備

選取體重約為200 g 的Wistar 大鼠（購自吉林大學(xué)實驗動物中心（長春））作為實驗動物。相關(guān)動物實驗均遵循實驗動物保護和使用委員會制定的操作條例。大鼠在適應(yīng)環(huán)境7 d 后被隨機分為4 組：（1）健康組（HCG，n=8）注射2.0 mL 0.9%NaCl；（2）低劑量組（LG，n=7）注射2.0 mL 25 μg/mL PEG-NaGdF4納米造影劑；（3）中劑量組（MG，n=7）注射2.0 mL 50 μg/mL PEG-NaGdF4納米造影劑；（4）高劑量組（HG，n=6）注射2.0 mL 100 μg/mL PEG-NaGdF4納米造影劑。處理后的大鼠放入代謝籠中，收集18 h 尿液，尿液樣品經(jīng)離心（10000 r/min，10 min）后，收集上清液，于–80 ℃儲存。樣品在UPLC-ESI-QTOF/MS 上樣前，于4 ℃解凍，然后用0.22 μm 濾膜過濾。

1.2.4 色譜-質(zhì)譜檢測條件

色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸溶液，流動相B 為乙腈。梯度洗脫：0～5 min，95%～88% A；5～8 min，88%～50% A；8～10.5 min，50%～0% A。流速為0.4 mL/min。進樣量為10 μL，進樣室溫度為4 ℃，柱溫為25 ℃。

質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采集范圍為m/z50～1000，離子源溫度150 ℃，萃取錐電壓5.0 V，錐孔氣流速50 L/h。正離子模式下毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓40 V，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速420 L/h；負(fù)離子模式下毛細管電壓2.5 kV，錐孔電壓30 V，脫溶劑氣溫度320 ℃，脫溶劑氣流速400 L/h。采用甲酸鈉建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2 ng/mL 亮氨酸腦啡肽進行實時質(zhì)量校正。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用UPLC-ESI-QTOF/MS 對大鼠尿液樣品進行檢測，利用Progenesis QI 軟件（Waters）對獲得的相關(guān)原始數(shù)據(jù)進行峰對齊、峰檢測和歸一化處理。通過精確分子量-保留時間和歸一化后的峰面積建立數(shù)據(jù)矩陣，采用EZinfo 2.0 軟件（Waters）對其進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）。相關(guān)生物標(biāo)志物和代謝通路采用相關(guān)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫進行鑒定和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG-NaGdF4的理化性質(zhì)表征

采用透射電子顯微鏡（TEM）對PEG-NaGdF4的微觀形貌進行表征。如圖1A 所示，制備的PEG-NaGdF4的尺寸約為100 nm。PEG-NaGdF4的紅外光譜（FTIR）如圖1B 所示，在3434、2855、2929、1645 和1112 cm–1處有紅外吸收峰，分別歸屬于O—H 的伸縮振動、—CH2—的對稱伸縮振動、—CH2—的不對稱伸縮振動、—CH2—的剪式振動以及C—O—C 的伸縮振動，表明PEG 被成功修飾到NaGdF4表面。采用熱重分析（TGA）測試對了PEG 在納米粒子中的含量（圖1C）。由TGA 測試結(jié)果計算得到PEG 約占PEG-NaGdF4總重量的1.01%。PEG-NaGdF4的X 射線多晶衍射（XRD）圖如圖1D 所示，通過與數(shù)據(jù)庫中的JCPDS 卡片對比后得出合成的PEG-NaGdF4為立方相晶體。以上結(jié)果證明通過一鍋水熱法已經(jīng)成功合成了PEG-NaGdF4。

圖1 聚乙二醇修飾的四氟化釓鈉納米粒子（PEG-NaGdF4）的理化性質(zhì)表征：（A）透射電子顯微鏡（TEM）圖；（B）傅里葉紅外（FTIR）光譜圖；（C）熱重分析（TGA）圖；（D）X-射線衍射（XRD）圖Fig.1 Characterization of polyethylene glycol-modified gadolinium sodium tetrafluoride (PEG-NaGdF4)nanoparticles: (A) Transmission electron microscopy (TEM) image;(B) Fourier transform infrared (FTIR)spectrum;(C) Thermogravimetric analysis (TGA);(D) X-ray diffraction (XRD) patterns

2.2 體內(nèi)外MRI造影效果評價

近年來，基于Gd 的納米粒子顯示出MRI 信號正增強的效果[8,20]。為了驗證構(gòu)建的PEG-NaGdF4的MRI 成像能力，對其進行了體內(nèi)外MRI 成像研究。結(jié)果顯示，在0～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，隨著PEG-NaGdF4濃度增加，其T1加權(quán)MRI 信號強度逐漸增強（圖2A）。當(dāng)濃度增加到200 μg/mL 時，PEG-NaGdF4納米造影劑的MRI 信號強度減弱，這可能是由T2*效應(yīng)和T1飽和導(dǎo)致的[31-32]。結(jié)合PEG-NaGdF4的體外MRI 成像效果，選取25、50 和100 μg/mL 的PEG-NaGdF4作為低、中、高劑量，研究其體內(nèi)MRI 成像效果。如圖2B 所示，與注射前相比，注射PEG-NaGdF4納米造影劑10 min 后，小鼠的MRI 成像圖顯示小鼠肝臟的對比度增強，并且中、高劑量組的MRI 成像效果明顯高于低劑量組。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的PEG-NaGdF4具有作為MRI 造影劑的潛力。

圖2 PEG-NaGdF4 納米造影劑的MRI 成像圖：（A）不同濃度的PEG-NaGdF4 體外核磁共振成像（MRI）圖；（B）低、中、高劑量PEG-NaGdF4 的體內(nèi)MRI 圖Fig.2 Magnetic resonance imaging (MRI) of PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents: (A) In vitro MRI images of different concentrations of PEG-NaGdF4;(B) In vivo MRI images of different concentrations of PEGNaGdF4

2.3 代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)已經(jīng)成為納米毒理學(xué)研究的重要工具，通過分析納米粒子對機體代謝水平的影響，為建立下游代謝物變化與信號通路變化的關(guān)系提供有效數(shù)據(jù)，并用于評價其生物安全性。為了評價構(gòu)建的PEG-NaGdF4納米造影劑的生物安全性，本研究采集了注射低、中、高劑量（25、50 和100 μg/mL）PEG-NaGdF4納米造影劑的大鼠的尿液樣本，采用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法進行分析。首先，采用PCA 方法對健康組和低、中、高劑量給藥組的大鼠尿液樣本進行分析。如圖3 所示，在正離子和負(fù)離子模式下，健康組（HCG）與低（LG）、中（MG）、高（HG）劑量給藥組大鼠的尿液代謝輪廓均區(qū)分明顯，說明PEG-NaGdF4納米造影劑進入大鼠體內(nèi)后改變了其尿液代謝物譜。此外，由PCA 得分圖中各點距離可知，LG 和MG 大鼠的狀態(tài)較相近。

圖3 健康組（HCG）、低劑量組（LG）、中劑量組（MG）和高劑量組（HG）大鼠尿液代謝組的主成分分析（PCA）得分圖：（A）正離子模式；（B）負(fù)離子模式Fig.3 Principal components analysis(PCA)score plots of rat urine metabolome in healthy control group(HCG),low-dose group(LG),moderate-dose group(MG)and high-dose group(HG):(A)Positive ion mode;(B)Negative ion mode

為了進一步篩選出潛在生物標(biāo)志物，采用OPLS-DA 方法對上述各組大鼠尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行了分析。在正離子和負(fù)離子模式下，健康組和低、中、高劑量組可以明顯聚類區(qū)分（圖4）；模型評價指標(biāo)見表1，結(jié)果表明模型可靠、質(zhì)量良好。圖5 是OPLS-DA 分析獲得的S-plot 圖，其中每個點均代表一種化合物，距離原點越遠的點，其代表的化合物對分組的影響越大，VIP 值（Variable importance in the projection）也越高，將VIP ≥1.0 且p<0.05 的代謝物作為潛在的生物標(biāo)志物。

表1 OPLS-DA模型評價指標(biāo)Table 1 Evaluation indexes of OPLS-DA model

圖4 大鼠尿液代謝組的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖：（A）正離子和（B）負(fù)離子模式下低劑量組與健康組；（C）正離子和（D）負(fù)離子模式下中劑量組與健康組；（E）正離子和（F）負(fù)離子模式下高劑量組與健康組Fig.4 Orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots of rat urine metabolome:LG vs.HCG in (A) positive ion mode and (B) negative ion mode;MG vs.HCG in (C) positive ion mode and(D) negative ion mode; vs.HCG in (E) positive ion mode and (F) negative ion mode

圖5 大鼠尿液代謝組的S-plot 分析結(jié)果：低劑量組和健康組在正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）下的S-plot；中劑量組和健康組在正離子模式（C）和負(fù)離子模式（D）下的S-plot；高劑量組和健康組在正離子模式（E）和負(fù)離子模式（F）下的S-plotFig.5 S-plots of rat urine metabolome:S-plots of OPLS-DA for LG and HCG under (A) positive ion mode and(B) negative ion mode;S-plots of OPLS-DA for MG and HCG under (C) positive ion mode and (D) negative ion mode;S-plots of OPLS-DA for HG and HCG under (E) positive ion mode and (F) negative ion mode

為了篩選出大鼠尿液中的潛在生物標(biāo)志物，將精確分子量和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品或數(shù)據(jù)庫中的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行對比，最終確定其結(jié)構(gòu)。如電子版文后支持信息表S1 所示，在高劑量組中共篩選出15 種潛在生物標(biāo)志物，其中，7 種化合物是低劑量組的潛在生物標(biāo)志物，8 種化合物是中劑量組的潛在生物標(biāo)志物，這些潛在生物標(biāo)志物涉及苯丙氨酸代謝、能量代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝和脂肪酸代謝等代謝通路。

對甲酚是苯丙氨酸和酪氨酸經(jīng)腸道厭氧菌作用的代謝產(chǎn)物，被葡萄糖醛酸化和硫酸化后，分別生成對甲酚葡萄糖醛酸和對甲酚硫酸鹽。有研究表明，對甲酚硫酸鹽會引起內(nèi)皮損傷并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[33-34]。由電子版文后支持信息表S1 可知，注射不同劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑后，大鼠尿液中對甲酚葡萄糖醛酸和對甲酚硫酸鹽含量均有所升高，表明PEG-NaGdF4納米造影劑會使大鼠的苯丙氨酸代謝發(fā)生擾動。

三羧酸循環(huán)是生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，又稱檸檬酸循環(huán)。該循環(huán)可為生物體提供能量，涉及機體的能量代謝。由電子版文后支持信息表S1 可知，注射不同劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑后，大鼠尿液中檸檬酸含量均有所下降，表明PEG-NaGdF4納米造影劑使大鼠能量代謝發(fā)生擾動。

在嘌呤代謝過程中，尿酸是代謝產(chǎn)物。尿囊素在大鼠體內(nèi)可由尿酸酶催化氧化尿酸產(chǎn)生。由電子版文后支持信息表S1 可知，高劑量組尿酸和尿囊素含量異常升高，而在低劑量組和中劑量組中無嘌呤代謝異常，表明高劑量組中大鼠嘌呤代謝發(fā)生擾動。

電子版文后支持信息表S1 中的生物標(biāo)志物吲哚-3-羧酸、吲哚-3-羧酸-葡萄糖醛酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸、硫酸吲哚酚及犬尿酸均屬于色氨酸的代謝產(chǎn)物，涉及色氨酸代謝通路，這些化合物的含量增加表明色氨酸分解增多。有研究表明，體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)時色氨酸消耗增加[35]。本研究中，硫酸吲哚酚、犬尿酸及吲哚-3-羧酸-葡萄糖醛酸在低劑量組中含量增加。中劑量組中，除了上述3 種生物標(biāo)志物含量增加外，吲哚-3-羧酸的含量也升高。注射高劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑后，大鼠體內(nèi)的5 種生物標(biāo)志物含量均增加。上述結(jié)果表明，注射低、中、高劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑后，會引發(fā)大鼠機體不同程度的炎癥反應(yīng)，并且隨著納米造影劑劑量增加而增大。

癸二酸及壬二酸是2 種二元羧酸，涉及體內(nèi)的脂肪酸代謝。在高劑量組，二者含量均升高；在中劑量組，壬二酸含量增高；在低劑量組，癸二酸含量升高。上述研究結(jié)果表明，PEG-NaGdF4納米造影劑會引起體內(nèi)脂肪酸代謝異常。

馬尿酸是一類尿毒素，在體內(nèi)通常由肝臟和腎臟的線粒體合成，由腎小管上皮細胞分泌排出。有研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者體內(nèi)馬尿酸含量增多[36]。肌酐是肌肉代謝的產(chǎn)物，肌肉中的肌酸主要通過不可逆的非酶脫水反應(yīng)緩慢地形成肌酐。在臨床檢測中，肌酐用于評價腎功能，腎功能受損時肌酐含量升高。此外，12-酮基脫氧膽酸可作為腎損傷初期的標(biāo)志物[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射高劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑后，大鼠體內(nèi)的馬尿酸、肌酐和12-酮基脫氧膽酸的含量均升高，表明高劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑會引起一定程度的大鼠腎功能損傷。但是，在對健康組和低、中、高劑量組大鼠的腎組織切片結(jié)果分析時，并未觀察到明顯異常（圖6），這說明在組織學(xué)檢測中并未發(fā)現(xiàn)大鼠產(chǎn)生腎損傷。

圖6 健康大鼠和注射不同劑量PEG-NaGdF4 納米造影劑后的大鼠腎組織切片圖Fig.6 Hematoxylin-eosin(H&E)staining images of kidneys harvested from healthy rats and rats after injection of different concentrations of PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents

上述代謝組學(xué)的研究結(jié)果表明，不同劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑對大鼠各個代謝通路的相關(guān)生物功能影響不同，并且呈濃度依賴性。低劑量及中劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑對大鼠機體代謝的影響較小，具有良好的生物安全性；高劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑會引起大鼠的能量代謝、脂類代謝及氨基酸代謝異常，并引發(fā)一定程度的炎癥反應(yīng)和腎功能損傷。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了基于PEG-NaGdF4的MRI 納米造影劑，采用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)分析了不同劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑對大鼠尿液代謝組的影響，最終對其生物安全性進行了評價。通過對各代謝組實驗數(shù)據(jù)進行分析，在低、中、高劑量組中分別鑒別出7、8 和15 種潛在生物標(biāo)志物。進一步對相關(guān)代謝通路進行分析，發(fā)現(xiàn)不同劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑對大鼠代謝的影響不同。其中，低和中劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑對各個代謝通路的相關(guān)生物功能影響較小；高劑量的納米造影劑會在短時間內(nèi)引起機體一定程度的炎癥和腎損傷。MRI 成像及代謝組學(xué)相關(guān)結(jié)果表明，中劑量的PEG-NaGdF4納米造影劑有成為安全、高效的MRI 造影劑的潛能，有望用于臨床醫(yī)學(xué)檢測。

支持信息

Supporting Information

表S1 PEG-NaGdF4 納米造影劑對大鼠尿液代謝影響的潛在生物標(biāo)志物TableS1 Potential biomarkers of urine metabolites induced by PEG-NaGdF4 nanoparticulate contrast agents