吳穎臻，楊福劍，杜文珍，陳瑩，張宗堯，磨美蘭，黃騰，謝慶華，黃裕富，唐雪梅*，韋天超*

(1. 廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530005；2. 廣西參皇養(yǎng)殖集團有限公司，廣西 玉林 537000)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是一種重要的禽類病原體，可引起家禽呼吸道疾病和關(guān)節(jié)炎性滑膜炎。MS感染的雞多呈隱性經(jīng)過，導(dǎo)致出現(xiàn)嚴重的免疫抑制、生長發(fā)育遲緩，還會引起產(chǎn)蛋下降，造成較大的經(jīng)濟損失[1]。該病原主要傳播方式是水平傳播，還可經(jīng)蛋垂直傳播[2]。

目前MS感染常用診斷方法包括：病原分離培養(yǎng)，血清學診斷和分子生物學方法。其中病原分離培養(yǎng)所需的成本高，耗時長，培養(yǎng)的條件苛刻，不適合快速診斷和檢測；血清學診斷雖方便快捷，但其敏感性低，存在交叉反應(yīng)，所以常與其他診斷結(jié)果一起判斷；分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)雖比分離培養(yǎng)方便快捷，但其所檢測的場地有所限制，對儀器以及人員要求高[3]。重組酶介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(recombinase-aided amplification，RAA)是近年來建立的一種新型體外核酸擴增手段，所用的重組酶是從細菌或真菌中分離獲得的，該技術(shù)在常溫等溫條件下(一般為 37～42 ℃)反應(yīng)5～30 min即可實現(xiàn)對目的基因片段的擴增[4]。RAA對設(shè)備要求低，普通RAA法特異性好、靈敏度高，只需要一個水浴鍋就可完成擴增，耗時短(5～30 min)、操作簡便且無需專業(yè)人員也能進行操作，適合在基層或者經(jīng)濟欠發(fā)達的地區(qū)推廣。RAA技術(shù)已在病原體檢測、疾病診斷等多個領(lǐng)域成功應(yīng)用[5-7]。本研究建立了MS的RAA新型檢測方法，為MS感染的診斷與流行病學調(diào)查提供了重要手段。

1 材料與方法

1.1 菌(毒)株核酸模板

本研究中使用的滑液囊支原體(MS)疫苗株MS-H株、雞毒支原體(MG)TS-11株、大腸桿菌(E.coli)參考株(ATCC25922)、沙門菌(SE)參考株 (CVCC538)、新城疫病毒(NDV)La Sota株、禽傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)K317株、禽呼腸孤病毒(ARV)CA株、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)H120株、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)以及實驗室3株MS分離株的DNA或cDNA均儲存在-20 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑

細菌DNA提取試劑盒購自上海生工有限公司；DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；酚/氯仿(1∶1)購自索萊寶生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和質(zhì)粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；RAA核酸擴增試劑盒(基礎(chǔ)型)購自杭州眾測生物科技有限公司。其他常規(guī)試劑由本實驗室保存。

1.3 引物的設(shè)計與合成

針對 GenBank公布的 MSvlhA基因序列(HQ326479.1)的保守區(qū)域，結(jié)合RAA反應(yīng)原理，采用Primer Primier 6.0與Oligo 7.0相結(jié)合設(shè)計2對特異性引物，以及文獻[8]提供的PCR引物F3/R3，均交由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

表1 引物名稱及序列

1.4 樣本處理

將棉拭子插入雞喉頭及上顎裂處，刮取分泌液，隨后將拭子放入含0.8～1 mL DMEM的2 mL 離心管中，置37 ℃ 100 r/min的搖床中，擴培12 h，用細菌DNA提取試劑盒提取。

1.5 RAA反應(yīng)體系的建立及引物篩選

在重組酶干粉的反應(yīng)管中先加入41.5 μL A Buffer，再依次加入2 μL上下游引物(10 μmol/L)、2 μL MS DNA，B Buffer 2.5 μL，混合均勻，放置于恒溫水浴鍋中39 ℃反應(yīng)30 min。待擴增結(jié)束后，加入酚/氯仿(1∶1)50 μL，振蕩均勻，12 000 r/min 離心3～5 min。取上層溶液8 μL進行凝膠電泳反應(yīng)(膠濃度1.5%)，電壓 120 V 反應(yīng) 30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上獲取結(jié)果。比較2對引物的擴增情況，篩選最佳引物。

1.6 標準質(zhì)粒的制備

選用RAA反應(yīng)體系中最優(yōu)的上下游引物，將提取的MS標準質(zhì)粒DNA按以下反應(yīng)體系：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共計35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)完畢，將擴增的片段連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR驗證后為陽性菌株，送至華大基因公司測序，測序結(jié)果在NCBI上比對，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，-20 ℃保存。

1.7 RAA反應(yīng)體系的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L的上下游引物，同時確保其它反應(yīng)體系不變，篩選出最佳引物濃度。

反應(yīng)時間的優(yōu)化，分別進行10、15、20、25和30 min擴增，同上篩選出最佳反應(yīng)時間。

確定最優(yōu)引物濃度和反應(yīng)時間后，設(shè)置反應(yīng)溫度為25、27、29、31和33 ℃，用上述方法進行檢測，篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.8 RAA法特異性和敏感性的評估

分別取MS、MG、E.coli、SE、NDV、IBV、ILTV、ARV、AIV的DNA或cDNA作為模板，進行擴增，以驗證該方法的特異性。

用分光光度計測定抽提的重組質(zhì)粒濃度，并將其按10倍倍比稀釋為10-10～10-1共10個濃度梯度，各取2 μL不同濃度的質(zhì)粒配制RAA反應(yīng)體系，設(shè)立ddH2O代替陽性質(zhì)粒模板的陰性對照，以選出其最優(yōu)敏感性。濃度計算公式：拷貝數(shù)(copies/μL)=(濃度ng/μL×6.02×1023×10-9)/(擴增片段長度×660)。

1.9 重復(fù)性試驗

選取不同濃度質(zhì)粒標準品(6.53×1011copies/μL、6.53×109copies/μL、6.53×107copies/μL)作為模板按照已經(jīng)優(yōu)化好的RAA法進行3次重復(fù)性試驗，以驗證該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣本檢測

選取臨床表現(xiàn)為精神不振、伴有輕微呼吸道癥狀，個別表現(xiàn)出單側(cè)或雙側(cè)關(guān)節(jié)、腳墊腫大，走路困難的患病雞只，采集其咽喉拭子共計100份，按照1.5提取樣本DNA作為模板，用優(yōu)化好的RAA法對其進行檢測。同時根據(jù)文獻[8]中常規(guī)PCR法，合成特異性引物F3/R3(見表1)，進行常規(guī)PCR檢測，比較2種方法的檢測結(jié)果，驗證新建立方法的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAA法引物的篩選以及建立

針對MSvlhA基因設(shè)計出的2對引物，兩兩組合后，通過觀察條帶的大小以及條帶的亮度來篩選出最優(yōu)的引物組合，其擴增產(chǎn)物的結(jié)果如圖1所示，通過擴增效率選擇 F2/R1 為最優(yōu)引物組合，其擴增片段長度為188 bp。

M. DL2000 DNA Marker；1. F1/R1；2. F1/R2；3. F2/R1；4. F2/R2；N.陰性對照。

2.2 引物濃度的優(yōu)化

結(jié)果如圖2所示，擴增出目的條帶的引物最低濃度為0.2 μmol/L，隨著引物濃度的增加，擴增效率逐漸增強。綜合考慮，選擇引物濃度為0.4 μmol/L，上下游引物添加量各為2 μL。

M. DL2000 DNA Marker；1～5.0.5～0.1 μmol/L；N.陰性。

2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

確定最優(yōu)引物濃度后，保持其他條件不變的情況下，設(shè)置時間梯度，結(jié)果如圖3所示，在10 min時便能擴增出目的條帶，但在15 min后會有雜帶出現(xiàn)，即選擇反應(yīng)時間為15 min。

M. DL2000 DNA Marker；1. 10 min；2. 15 min；3. 20 min；4. 25 min；5. 30 min；N.陰性對照。

2.4 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

結(jié)果如圖4所示，在25～33 ℃之間均能擴增出條帶。在29 ℃時條帶最亮，擴增效率最高，在30～33 ℃則會有雜帶出現(xiàn)，即最優(yōu)的反應(yīng)溫度為29 ℃。

M.DL2000 DNA Marker；1. 25 ℃；2. 27 ℃；3. 29 ℃；4. 31 ℃；5. 33 ℃；N.陰性對照。

2.5 RAA法特異性

利用建立好的基礎(chǔ)RAA方法，對MS、MG、E.coli、SE、NDV、IBV、ILTV、ARV、AIV進行擴增，結(jié)果如圖5所示，只有MS出現(xiàn)特異性條帶，其余病原核酸的檢測結(jié)果均為陰性，表明RAA檢測方法具有良好的特異性，與其他常見禽病原體無交叉反應(yīng)。

M.DL2000 DNA Marker；1～4. MS；5. MG；6. E.coli；7. SE；8. NDV；9. IBV；10. ILTV；11. ARV；12. AIV。

2.6 RAA法敏感性

測定MS重組質(zhì)粒濃度為134.68 ng/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后的濃度分別為6.53×1010～6.53×101copies/μL。結(jié)果顯示，模板量低于6.53×105copies/μL時，未見目的條帶(圖6A)，說明該方法對 MS 的最低檢出限度為6.53×105copies/μL；另外，用相同引物進行的常規(guī) PCR 最低檢出限度為13.06×107copies/μL(圖6B)，因此，建立的RAA比普通PCR靈敏度高出100倍。

M.DL2000 DNA Marker；1～10. 濃度分別為6.53×1010～6.53×101 copies/μL；N.陰性對照。

2.7 重復(fù)性試驗

選取濃度為6.53×1011copies/μL的重組質(zhì)粒作為重復(fù)性試驗結(jié)果代表，如圖7所示。試驗結(jié)果顯示均能擴增出目的條帶，且條帶大小與試驗預(yù)期相符，無明顯差異，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

M.DL2000 DNA Marker；1～3. 濃度為134.68 ng/μL的質(zhì)粒3次重復(fù)性試驗；N.陰性對照。

2.8 樣品檢測

應(yīng)用建立的MS RAA法對臨床樣品進行檢測，結(jié)果如表2所示，與常規(guī)PCR結(jié)果100%符合，且2種檢測方法結(jié)果為陽性的均是來自同一臨床病料，表明RAA法完全適用于臨床。

表2 臨床樣品的檢測

3 討論

滑液囊支原體在雞群感染日益嚴重，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[9]。病原分離培養(yǎng)雖是鑒定MS的金標準，但其培養(yǎng)條件苛刻、周期長，操作復(fù)雜，不適應(yīng)養(yǎng)禽業(yè)疾病快速診斷的需要。血清學檢查易出現(xiàn)假陽性不適用于臨床早期診斷[10]；PCR雖然準確率比病原分離培養(yǎng)要高，但MS在體內(nèi)的數(shù)量隨著感染時間的延長可能在這些組織中含量過低，導(dǎo)致PCR的結(jié)果為陰性，而個體仍會發(fā)病[11]。鄧顯文等[12]建立的LAMP方法雖然可在水浴鍋中62 ℃反應(yīng)1 h，90 ℃作用5 min滅活，便能讀出結(jié)果，但其設(shè)計引物復(fù)雜。目前所建立的分子生物學檢測方法普遍存在相對費時且不適用現(xiàn)場快速檢測的缺點[13]。研究和建立一種快速有效、簡便的檢測方法對防控MS的傳播和我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重大意義。

RAA技術(shù)是我國近些年來自主研發(fā)，很適合在基層和資源匱乏的地區(qū)推廣使用。Wang等[14]、Fan等[15]、Mu等[16]建立了用RAA技術(shù)檢測新城疫病毒、非洲豬瘟病毒和大腸桿菌O157：H7的方法。本研究通過設(shè)計2對引物兩兩結(jié)合進行篩選，選擇出最優(yōu)的1對引物，在29 ℃條件下發(fā)生等溫擴增反應(yīng)，15 min內(nèi)便出檢測結(jié)果，其檢測的最低靈敏度為6.53×105copies/μL，具有較好的特異性。對收集的臨床樣本，所得結(jié)果與普通PCR一致。卞紅春等[17]建立的方法是在38 ℃ 25 min可檢測出MS，其敏感性為15.5 pg/μL，而本研究在同類方法上有所優(yōu)化，反應(yīng)溫度更接近常溫，更省時，敏感性更高。

RAA引物比PCR引物要長，沒有專門的設(shè)計軟件，所以在設(shè)計時需符合其原則。其最優(yōu)長度一般在30～36 bp，低于30 bp、高于36 bp也可用，但是最長不能超過45 bp。5′端要避免出現(xiàn)多個G，最佳為C 或T；3′端最佳為G 和 C；GC含量介于40%～60%為最佳，避免引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)[16]。對擴增產(chǎn)物的長度也有要求，擴增產(chǎn)物的片段大小為100～200 bp 最佳，建議不超500 bp，這兩點引物設(shè)計原則可使反應(yīng)更加靈敏。克服RAA檢測方法的不足之處還需進一步的探索。

綜上所述，本研究建立了MS RAA 新型檢測方法，該方法檢測時間短，反應(yīng)靈敏，特異性好，對儀器以及人員的要求不高，適用于在養(yǎng)殖場等現(xiàn)場進行檢測，為MS感染的診斷和流行病學調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。