梅堃，劉夢(mèng)凡，李文俊，葉賀佳，朱秀同，李雨澤，陸泳錕，徐航，尹政浩，黃淑堅(jiān)*

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2. 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣東 佛山 528000)

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu Virus，DTMUV)感染引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降，育成鴨和雛鴨生長(zhǎng)緩慢、癱瘓、神經(jīng)癥狀的新發(fā)傳染病[1]，又稱(chēng)鴨出血性卵巢炎、鴨傳染性減蛋綜合征、鴨病毒性腦炎等[2]。DTMUV最早于1955年首次從馬來(lái)西亞庫(kù)蚊體內(nèi)分離得到[3]，2010年4月于我國(guó)首次暴發(fā)，并迅速波及華南、華北、東南等地區(qū)的水禽養(yǎng)殖場(chǎng)[4-6]。該病死亡率低于10%，但感染后發(fā)病率可高達(dá)100%[7]。

DTMUV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑約為45～60 nm，呈球形，具有囊膜結(jié)構(gòu)，表面有棘突[8-9]。病毒基因組由1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)及5′UTR和3′UTR組成。ORF編碼的唯一多聚蛋白前體酶解成衣殼蛋白(C)、膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)等3種結(jié)構(gòu)蛋白及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等7種非結(jié)構(gòu)蛋白[10-11]。其中，C蛋白能與病毒基因組相互結(jié)合組裝成核衣殼，保護(hù)基因組免受RNA酶降解[12-14]；E蛋白主要決定病毒細(xì)胞嗜性及毒力，也是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[15-16]；成熟的prM蛋白嵌合在病毒囊膜的脂質(zhì)雙分子層中，維持病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在病毒的組裝和釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17-18]；NS5蛋白對(duì)病毒基因組的復(fù)制起關(guān)鍵作用，且能夠參與調(diào)控機(jī)體多種抗病毒反應(yīng)，該蛋白最為保守，可用于DTMUV分類(lèi)鑒別[19]。

本研究采集廣東省肇慶市某麻鴨養(yǎng)殖基地中出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病鴨肝臟、脾臟等組織，成功分離并鑒定出1株DTMUV，命名為GDSH07株，經(jīng)NS5蛋白基因序列分析發(fā)現(xiàn)分離病毒屬于clade2.2(國(guó)內(nèi)流行株)；對(duì)該分離株測(cè)定TCID50并進(jìn)行雛麻鴨致病性試驗(yàn)，旨在探究DTMUV在華南地區(qū)的分子遺傳演化及感染雛麻鴨的致病機(jī)制，為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物

病料為廣東省肇慶市某麻鴨養(yǎng)殖基地病鴨肝臟、脾臟、腦組織；DTMUV-GDJM08、DTMUV-GDQY10、DTMUV-GDZJ09、DTMUV-GDCZ08毒株和BHK-21細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存；鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)來(lái)源于廣東省廣州市增城區(qū)某種鴨場(chǎng)無(wú)DTMUV抗體的9日齡鴨胚；病毒總RNA提取試劑盒(批號(hào)：220011)購(gòu)于上海飛捷生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒(批號(hào)：KR116)、DNA膠回收試劑盒(批號(hào)：DP219)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；PremixTaqTM(批號(hào)：R004Q)、pMD19-T載體連接試劑盒(批號(hào)：6013)購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的DTMUV毒株的序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。P1用于臨床樣本的鑒定，P2用于擴(kuò)增DTMUV NS5基因全長(zhǎng)，P3用于擴(kuò)增DTMUV E基因全長(zhǎng)。引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物技術(shù)股份有限公司合成。

表1 設(shè)計(jì)引物序列

1.2.2 樣品處理和病毒分離

無(wú)菌條件下，取研磨管加入含1%青、鏈霉素的PBS溶液和高壓滅菌的3 mm研磨鋼珠，將所收集的病料組織剪碎混于研磨管中，研磨，-80 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清液。

分別采用BHK-21及DEF細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。將過(guò)濾后的組織上清液取300 μL接種到單層BHK-21及DEF細(xì)胞上，每12 h觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，待CPE達(dá)到80%時(shí)收獲病毒，-80 ℃反復(fù)凍融3次，連續(xù)盲傳3代，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR鑒定

使用病毒總RNA提取試劑盒提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用P1作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 間接免疫熒光(IFA)鑒定

將BHK-21細(xì)胞鋪在12孔板中，24 h后待細(xì)胞形成單層后，用PBS清洗2遍，加BHK-21細(xì)胞病毒液37 ℃作用1～1.5 h，同時(shí)設(shè)置未接毒細(xì)胞對(duì)照，作用結(jié)束后加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。棄掉上清液，PBS溫和洗3次，加入預(yù)冷的固定液(80%甲醇+20%丙酮)，PBS清洗3次后封閉，以DTMUV滅活疫苗(HB株)為抗原免疫5周齡BALB/c小鼠3次，獲得鼠抗DTMUV抗體血清作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 NS5基因、E基因鑒定及遺傳進(jìn)化分析

以1.2.3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，用P2、P3引物進(jìn)行NS5基因及E基因PCR鑒定，PCR體系25 μL：ExTaq酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束取部分產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察是否有目的條帶。陽(yáng)性條帶回收、克隆，送至上海生工生物有限公司測(cè)序。使用Mega X(10.1.8)對(duì)GDSH07株與GenBank中已發(fā)表的其他DTMUV及實(shí)驗(yàn)室保存的DTMUV-GDJM08、GDQY10、GDZJ09、GDCZ08 NS5基因及E基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.2.6 病毒滴度測(cè)定

以2×105個(gè)/孔DEF及BHK-21細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；取100 μL細(xì)胞病毒液，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9；棄去96孔板中培養(yǎng)液，PBS清洗2次，陰性對(duì)照加入100 μL含2% FBS的DMEM，隨后由高至低稀釋度加入稀釋后的病毒液，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔200 μL，置37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)96 h；觀察并計(jì)錄各梯度中出現(xiàn)細(xì)胞病變，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.2.7 動(dòng)物致病性

將30只1日齡的健康雛麻鴨隨機(jī)分成A、B兩組，每組15只，A組通過(guò)肌肉注射接種細(xì)胞毒0.2 mL(TCID50=10-6，0.2 mL)，B組15只為陰性對(duì)照組，接種0.2 mL PBS，。分別于接種后3、7、11 d，每組各取5只雛麻鴨剖檢采樣，采集肝臟、脾臟、胸腺、腦、法氏囊，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的熒光定最PCR(qPCR)檢測(cè)方法檢測(cè)各組織器官中的病毒載量。取肝臟、脾臟、腦組織制作常規(guī)石蠟切片，觀察相關(guān)組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定

2.1.1 病毒分離及病變觀察

將病鴨肝臟、脾臟、腦組織等研磨過(guò)濾后，取300μL組織上清液分別接至DEF細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞，連續(xù)盲傳3代(每代培養(yǎng)96 h)。傳至第3代，DEF細(xì)胞可在感染后48 h出現(xiàn)明顯CPE，細(xì)胞變圓、間隙增寬，見(jiàn)圖1；BHK-21細(xì)胞感染后48 h病變明顯，細(xì)胞圓縮脫落、崩解細(xì)胞折光性增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。72 h時(shí)2種細(xì)胞CPE均達(dá)70%以上。

a. 48 h對(duì)照組細(xì)胞；b. 48 h感染組細(xì)胞。

a. 48 h對(duì)照組細(xì)胞；b. 48 h感染組細(xì)胞。

2.1.2 PCR鑒定

將細(xì)胞上清液提取RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，目的基因片段與預(yù)期結(jié)果相符，約220 bp(如圖3)。

M. DL2000 DNA Marker；1. 陰性對(duì)照；2. GDSH07株。

2.1.3 間接免疫熒光鑒定

間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：BHK-21細(xì)胞感染GDSH07株后36 h，倒置熒光顯微鏡下可觀察到感染組BHK-21細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)特異性綠色熒光，對(duì)照組未見(jiàn)熒光見(jiàn)圖4。結(jié)果表明GDSH07株感染后主要存在于BHK-21細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 間接免疫熒光鑒定GDSH07株感染BHK-21細(xì)胞(200×)

2.1.4 病毒NS5基因、E基因鑒定及遺傳進(jìn)化分析

收集感染GDSH07株的DEF及BHK-21第4代細(xì)胞上清液，使用引物P2、P3進(jìn)行NS5基因及E基因序列全長(zhǎng)擴(kuò)增，結(jié)果顯示，NS5基因條帶約2 700 bp(見(jiàn)圖5)，E基因條帶約1 500 bp(見(jiàn)圖6)，均與預(yù)期大小相符合。

M. DL5000 DNA Marker；1. GDSH07株NS5基因；2. 陰性對(duì)照。

M. DL5000 DNA Marker；1. GDSH07株E基因。

將GDSH07株 NS5基因、E基因的測(cè)序結(jié)果分別經(jīng)過(guò)DNAstar SeqMan(7.1.0)軟件拼接，與GenBank已發(fā)表的序列進(jìn)行比對(duì)，確定本研究分離毒株GDSH07株為DTMUV。使用MEGA X(10.1.8)與已發(fā)表的DTMUV及實(shí)驗(yàn)室保存的DTMUV-GDJM08、DTMUV-GDQY10、DTMUV-GDZJ09、DTMUV-GDCZ08毒株NS5基因、E基因進(jìn)行比對(duì)，并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。由圖7可知，GDSH07株與本實(shí)驗(yàn)室已保存毒株DTMUV-GDJM08、DTMUV-GDZJ09、DTMUV-GDQY10位于同一分支，即屬于國(guó)內(nèi)主要流行株clade 2.2；與馬來(lái)西亞源流行株D1921株(clade 2.1)相似性最低，為92.4%。NS5蛋白序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示，GDSH07株與D1921株(clade 1)相似性為97.9%，與其他參考株相似性為98.1%～100%。由圖8可知，GDSH07株E基因與實(shí)驗(yàn)室保存GDJM08株相似性高，為99.6%；與馬來(lái)西亞源流行株D1921株相似性?xún)H為92.6%；與我國(guó)早期分離株FX2010相似性為98.7%。

明確中國(guó)有構(gòu)建國(guó)際商事法庭的必要性之后，在設(shè)計(jì)國(guó)際商事法庭的具體規(guī)則之前，我們需要考慮的是中國(guó)國(guó)際商事法庭的定位問(wèn)題，或者說(shuō)是中國(guó)國(guó)際商事法庭的管轄標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題。該問(wèn)題直接決定了中國(guó)國(guó)際商事法庭如何建設(shè)。

?本研究分離株。下同。

圖8 DTMUV-GDSH07 E基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.1.5 GDSH07株病毒滴度測(cè)定

將感染GDSH07株的DEF和BHK-21細(xì)胞上清液收集后用病毒稀釋液進(jìn)行倍比稀釋(10-1～10-8個(gè)濃度梯度)，每個(gè)梯度重復(fù)3孔，分別接種至DEF、BHK-21的96孔細(xì)胞板，陰性孔加入等量細(xì)胞維持液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)72 h后觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示該分離株感染DEF細(xì)胞的半數(shù)致死量為lg TCID50=-5.53，見(jiàn)表2；感染BHK-21為lg TCID50=-4.55，見(jiàn)表3。

表2 GDSH07株在DEF細(xì)胞上的CPE

表3 GDSH07株在BHK-21細(xì)胞上的CPE

2.2 對(duì)雛麻鴨的致病性研究

2.2.1 臨床癥狀及病理變化

雛麻鴨感染GDSH07株后3 d，可見(jiàn)精神沉郁、喜臥、采食量下降等；4 d出現(xiàn)死亡(1/15)，伴有抽搐、劃水等神經(jīng)癥狀，如圖9a；至7 d攻毒組發(fā)病率為80%(12/15)，死亡率為13%(2/15)；10 d攻毒組剩余雛麻鴨(10/15)表現(xiàn)為轉(zhuǎn)歸，采食量及精神狀態(tài)恢復(fù)正常。剖檢可見(jiàn)攻毒雛麻鴨肝臟有數(shù)量不等、大小不一的針尖狀出血點(diǎn)、出血斑(圖9b)，胸腺(圖9c)、脾臟(圖9d)明顯出血腫大，心內(nèi)膜(圖9e)、腦膜(圖9f)出血，對(duì)照組鴨只未見(jiàn)臨床癥狀及病變。

a.病鴨臨床表現(xiàn)；b.肝臟出血點(diǎn)；c.胸腺出血點(diǎn)；d.脾臟腫大；e.心內(nèi)膜出血；f.腦膜出血。

2.2.2 組織病毒載量測(cè)定

使用實(shí)驗(yàn)室已建立的qPCR方法檢測(cè)各組織病毒載量，結(jié)果如圖10所示。感染后3、7、11 d肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊、腦均可檢測(cè)到DTMUV，其中肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊病毒載量均在感染后3 d達(dá)到峰值，而腦在7 d達(dá)到峰值，隨后幾天逐漸下降；11 d檢測(cè)結(jié)果顯示各組織中的病毒載量較低，與臨床癥狀轉(zhuǎn)歸相符。

圖10 各組織病毒載量情況

2.2.3 病理組織學(xué)變化

病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝臟、腦、脾均無(wú)明顯組織學(xué)病變。GDSH07株感染1日齡雛麻鴨后7 d，可見(jiàn)部分肝細(xì)胞輕度空泡化、肝竇和肝小葉間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腦部可見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)及淋巴細(xì)胞管套現(xiàn)象；脾臟淋巴細(xì)胞明顯減少，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多，脾髓充血、白髓萎縮，紅髓和白髓邊界不清，可見(jiàn)大小不一的壞死灶。見(jiàn)圖11。

3 討論

自2010年鴨坦布蘇病毒病暴發(fā)以來(lái)，迅速波及我國(guó)各地，嚴(yán)重阻礙了水禽行業(yè)的健康發(fā)展。本研究從廣東省肇慶市某水禽養(yǎng)殖基地發(fā)病鴨分離到1株DTMUV，命名為GDSH07株。為了解其致病性，分別使用DEF、BHK21細(xì)胞及雛麻鴨進(jìn)行試驗(yàn)。其中，細(xì)胞攻毒研究結(jié)果顯示，GDSH07株病毒可感染DEF細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞，主要以細(xì)胞變圓、脫落、壞死為主；GDSH07株在BHK-21細(xì)胞中的TCID50(10-4.55)比在DEF細(xì)胞中(10-5.53)高，其原因可能是BHK-21細(xì)胞系來(lái)自哺乳動(dòng)物腎臟，為傳代細(xì)胞；而DEF細(xì)胞來(lái)源于9日齡鵝胚，為原代細(xì)胞，從而導(dǎo)致該差異[20]。

本研究中GDSH07株 NS5基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該毒株與國(guó)內(nèi)分離株FJMH220親緣關(guān)系最近，屬同一分支(clade 2.2)，為國(guó)內(nèi)主要流行毒株；E基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GDSH07株與馬來(lái)西亞源分離株D1921相似性最低，為92.6%。E基因主要決定病毒細(xì)胞嗜性及毒力，據(jù)報(bào)道，DTMUV的E基因S338R、E120、E388等重要位點(diǎn)突變對(duì)病毒的致病力產(chǎn)生顯著影響[21]。劉龍等[22]研究表明，DTMUV的E蛋白S338R突變影響病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和病毒對(duì)受體的吸附能力，降低神經(jīng)毒性；王賓賓[23]研究發(fā)現(xiàn)，E120位點(diǎn)由D變?yōu)镹是DTMUV疫苗株FX2010-180P毒力減弱的關(guān)鍵。1日齡雛麻鴨感染GDSH07株病毒后病理組織切片顯示肝細(xì)胞輕度空泡化、腦部出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)及淋巴細(xì)胞管套現(xiàn)象；脾臟淋巴細(xì)胞明顯減少，且脾臟出現(xiàn)大小不一的壞死灶，但Zalan等[24]研究發(fā)現(xiàn)馬來(lái)西亞D1921株病毒感染2周齡北京鴨，病變主要見(jiàn)于腦和脊髓，表現(xiàn)為非化膿性全腦脊髓炎、血管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)，而其他組織器官并未出現(xiàn)明顯病變，只能偶爾觀察到脾臟腫大。GDSH07株與馬來(lái)西亞D1921株病理變化不同，可能原因：一是由于重要基因的某些關(guān)鍵位點(diǎn)突變導(dǎo)致；二是DTMUV對(duì)不同日齡不同品種鴨的致病力的區(qū)別。呂傳位等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)X2010株DTMUV 對(duì)10日齡雛鴨最易感，55周齡產(chǎn)蛋鴨較易感，15周齡鴨抵抗力增強(qiáng)。徐夢(mèng)迪等[26]研究發(fā)現(xiàn) XZ-2012株DTMUV感染7日齡鴨后脾臟損傷更嚴(yán)重，脾臟橢球周?chē)霈F(xiàn)空泡變性，而6月齡鴨脾臟結(jié)構(gòu)基本正常。GDSH07株病毒攻毒3 d后，雛麻鴨各主要組織器官(肝、腦、脾、法氏囊、胸腺)均可檢測(cè)到病毒核酸，說(shuō)明DTMUV進(jìn)入機(jī)體后會(huì)快速擴(kuò)散到全身，組織嗜性廣，其中肝、脾、胸腺、法氏囊中的病毒載量均達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)。分析其原因，一方面可能與抗體依賴(lài)的病毒感染增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement of virus infection，ADE)有關(guān)，抗體滴度在低或高水平時(shí)對(duì)病毒存在中和作用，但在中度或亞中和滴度水平時(shí)與病毒形成病毒-抗體復(fù)合物，顯著增強(qiáng)Fc受體(FcR)或補(bǔ)體受體(CR)陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)該病毒的感染[27]；另一方面可能與細(xì)胞抗病毒免疫通路的激活程度有關(guān)。目前針對(duì)DTMUV感染后雛鴨抗病毒細(xì)胞免疫的激活程度及其相關(guān)免疫因子表達(dá)情況的研究相對(duì)較少，有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)前，對(duì)于鴨坦布蘇病毒病流行現(xiàn)狀，研究人員應(yīng)持續(xù)關(guān)注，加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、病毒遺傳變異分析和新型疫苗研發(fā)等。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)做好飼養(yǎng)管理工作，提高鴨群免疫力，控制該病的傳播與流行。