張穎蕾，陳蕾曉，李國(guó)艷，卓然，鐘真，黃遠(yuǎn)城，唐小川，王曉麗

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

隨著全球變暖，氣溫逐年升高，熱應(yīng)激對(duì)于動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、生理功能等均產(chǎn)生了不利影響，因此尋求緩解熱應(yīng)激的相關(guān)研究受到了廣泛關(guān)注[1-2]。睪丸是雄性動(dòng)物的生殖器官，參與睪酮的合成、精子的產(chǎn)生等正常生殖生理過程，有研究表明熱應(yīng)激對(duì)睪丸生精能力有顯著影響[3-4]。絞股藍(lán)多糖(Gynostemmapentaphyllumpolysaccharides，GPP)是葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)中的主要活性成分之一，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗衰老、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]。但有關(guān)絞股藍(lán)多糖對(duì)緩解熱應(yīng)激的研究較少，對(duì)熱應(yīng)激導(dǎo)致睪丸氧化損傷的保護(hù)作用還未見報(bào)道。因此，本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，以成年雄性小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，在相同的熱應(yīng)激條件下，觀察絞股藍(lán)多糖對(duì)熱應(yīng)激小鼠睪丸氧化損傷的保護(hù)作用，為絞股藍(lán)多糖的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供新的方向與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 絞股藍(lán)多糖的提取與糖含量測(cè)定

絞股藍(lán)原料購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。洗凈、烘干，經(jīng)粉碎3 cm過篩加工后，避光干燥保存。參考楊勤等[7]文章中提到的方法，實(shí)驗(yàn)室水提醇沉法提取絞股藍(lán)多糖，苯酚硫酸法測(cè)定絞股藍(lán)多糖含量為 71.1%。

1.2 主要試劑

TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1 法)、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(紫外法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測(cè)定試劑盒(比色法)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)、睪酮(TESTO)測(cè)試盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。雄激素受體(AR)免疫組化試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6周齡，體重(20±0.2)g，SPF級(jí)昆明系健康雄性小鼠，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證編號(hào)：SYXK桂2020-0004)50只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，隨機(jī)將小鼠分為5組：空白對(duì)照組(Con)、熱應(yīng)激對(duì)照組(HS)、絞股藍(lán)多糖低劑量組(GPP-L)、絞股藍(lán)多糖中劑量組(GPP-M)、絞股藍(lán)多糖高劑量組(GPP-H)，每組10只。Con組和HS組每天腹腔注射生理鹽水，其余組每天腹腔注射絞股藍(lán)多糖溶液，劑量按體重分別為50 mg/kg (GPP-L)、100 mg/kg(GPP-M)和200 mg/kg (GPP-H)，以10 mL/(kg·d)連續(xù)給藥，連續(xù)給藥2周后進(jìn)行連續(xù)7 d的熱應(yīng)激，應(yīng)激條件為38 ℃ 45 min接著42 ℃ 20 min，21 d后處死，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)采樣備用。

1.4 血清睪酮測(cè)定及臟器指數(shù)計(jì)算

小鼠末次用藥1 d后眼眶采血，分離血清，采用放射免疫分析法測(cè)定血清中睪酮含量，結(jié)果以ng/mL表示。處死后75%酒精浸泡消毒后剪開腹腔，取出雙側(cè)睪丸分別稱重，根據(jù)公式，臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/ 體重(g)×100%，計(jì)算睪丸指數(shù)。

1.5 曲精小管直徑測(cè)定

常規(guī)石蠟切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡(40×)下觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，拍照。通過Image Pro Plus軟件測(cè)量睪丸曲精小管直徑(每組隨機(jī)測(cè)定20個(gè)管徑，管徑以最長(zhǎng)管徑與最短管徑的平均值為準(zhǔn))，記錄并分析統(tǒng)計(jì)。

1.6 睪丸組織細(xì)胞凋亡及雄性激素受體的表達(dá)測(cè)定

按TUNEL原位凋亡及雄性激素受體(AR)檢測(cè)試劑盒說明書操作。光鏡下(40×)觀察組織細(xì)胞染色情況，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野。利用 Image Pro Plus軟件測(cè)定所選定視野凋亡細(xì)胞、AR陽性細(xì)胞累計(jì)光密度值(IOD)與視野下睪丸組織的面積(Area)，計(jì)算各個(gè)視野下的凋亡細(xì)胞、IOD/Area。

1.7 睪丸組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定

取睪丸組織，以重量∶體積為1∶9的比例加入帶冰的生理鹽水中，采用組織勻漿研磨機(jī)研磨各睪丸組織，勻漿后離心，取上清液進(jìn)行分裝，用于試劑盒檢測(cè)氧化損傷指標(biāo)丙二醛(MDA)的含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)都用IBM SPSS Statistics 26統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)采用單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)分析比較，LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間數(shù)據(jù)分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。使用Image Pro Plus軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 睪丸指數(shù)及血清睪酮含量的變化

通過對(duì)各組雙側(cè)睪丸分別稱重并計(jì)算睪丸指數(shù)，采用放射免疫分析法對(duì)各組血清中睪酮含量進(jìn)行測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示，GPP各劑量組睪丸指數(shù)與HS組比較均有所增長(zhǎng)，但差異不顯著。GPP-L和GPP-M組血清睪酮含量與HS組相比均顯著升高(P<0.05)，GPP-H與HS組無顯著差異，但均低于Con組。

2.2 睪丸組織形態(tài)學(xué)、曲精小管直徑的變化

各組睪丸分別進(jìn)行石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠睪丸生精小管及各級(jí)生精細(xì)胞的形態(tài)，如圖1所示?？瞻讓?duì)照組(圖1A)睪丸組織形態(tài)正常；熱應(yīng)激對(duì)照組(圖1B)睪丸生精小管生精上皮變薄，生精細(xì)胞數(shù)量減少，管腔內(nèi)見到脫落的生精細(xì)胞，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，且管腔內(nèi)精子數(shù)目減少；各絞股藍(lán)多糖組(圖1C、D、E)生精小管外形較規(guī)則，界膜較完整，生精上皮層數(shù)增多，生精細(xì)胞排列整齊、緊密，生精小管的結(jié)構(gòu)接近于正常組，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央，且精子數(shù)目較多。

A.Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組。

每組隨機(jī)對(duì)20個(gè)曲精小管直徑進(jìn)行測(cè)量分析，結(jié)果如表2所示。GPP各劑量組睪丸曲精小管直徑與HS組相比均顯著增大(P<0.05)，且GPP-L、GPP-M組曲精小管直徑顯著低于GPP-H和Con組(P<0.05)，GPP-H組曲精小管直徑顯著高于Con組(P<0.05)，GPP-L、GPP-M組間差異不顯著。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，表明絞股藍(lán)多糖可以改善熱應(yīng)激引起的睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷。

表2 曲精小管直徑的變化

2.3 細(xì)胞凋亡及AR的表達(dá)

經(jīng)TUNEL原位末端標(biāo)記后，如圖2所示，Con組有少量的細(xì)胞凋亡，熱應(yīng)激組凋亡細(xì)胞明顯增多，各GPP組的凋亡細(xì)胞與Con組相比有所增加。經(jīng)對(duì)凋亡細(xì)胞IOD/Area進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如表3所示，發(fā)現(xiàn)HS組凋亡細(xì)胞的IOD/Area與Con組相比顯著增大(P<0.05)，各GPP劑量組IOD/Area數(shù)值較HS組均有所減小，其中，GPP-M組數(shù)值較HS組顯著減小(P<0.05)且與Con組無顯著差異，GPP-L、GPP-H與HS組IOD/Area差異不顯著。

A.Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組；箭頭所指為TUNEL陽性細(xì)胞。

表3 睪丸凋亡細(xì)胞IOD/Area、雄性激素受體的變化

經(jīng)AR免疫組化染色后，如圖3所示，AR定位于細(xì)胞核，在曲細(xì)精管的基底膜處支持細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。HS組及各GPP組與Con組相比，AR陽性細(xì)胞減少，表達(dá)減弱。隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)AR陽性細(xì)胞IOD/Area進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如表3所示，發(fā)現(xiàn)HS組睪丸組織AR陽性細(xì)胞的IOD/Area與Con組相比顯著減小(P<0.05)，各GPP劑量組IOD/Area較熱應(yīng)激組均有所增大，其中GPP-L和GPP-M組AR表達(dá)程度與HS組相比顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

A. Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組；箭頭所指為TUNEL陽性細(xì)胞；箭頭所指為AR陽性細(xì)胞。

2.4 睪丸組織抗氧化指標(biāo)的變化

通過分光光度法，分別對(duì)睪丸組織中MDA、GSH-PX含量及SOD和CAT活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4，GPP-M和GPP-L組的MDA含量與HS組相比顯著降低(P<0.05)，但高于Con組；GPP-M和GPP-L組的GSH-Px含量、CAT活力、SOD活力與HS組相比顯著升高(P<0.05)，但均低于Con組；GPP-H組的CAT活力、SOD活力與HS組相比顯著升高(P<0.05)。

表4 睪丸組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA含量的變化

3 討論

睪丸對(duì)溫度非常敏感，有研究表明，熱應(yīng)激可導(dǎo)致睪丸萎縮，睪丸指數(shù)變小[7]。睪丸形態(tài)和睪丸指數(shù)是睪丸健康情況的重要指標(biāo)之一。劉慧娟等[2]在熱應(yīng)激小鼠日糧中添加蘆丁，發(fā)現(xiàn)其可以提高熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)，顯著增加熱應(yīng)激小鼠生精小管直徑，降低熱應(yīng)激小鼠生精細(xì)胞脫落比率；高琛等[4]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以導(dǎo)致小鼠睪丸系數(shù)降低，誘導(dǎo)小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷，黃芩苷可提高熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)，減輕熱應(yīng)激造成的小鼠睪丸損傷；吳璟等[8]給熱應(yīng)激小鼠灌胃葫蘆巴堿，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯改善熱應(yīng)激對(duì)小鼠睪丸的損傷程度，生精小管各級(jí)層數(shù)明顯增多，生精細(xì)胞排列整齊。本研究也發(fā)現(xiàn)GPP可以提高熱應(yīng)激小鼠睪丸指數(shù)，顯著增加熱應(yīng)激小鼠曲精小管直徑，改善熱應(yīng)激對(duì)小鼠睪丸的損傷程度-曲精小管外形較規(guī)則，界膜較完整，生精上皮層數(shù)增多，生精細(xì)胞排列整齊、緊密，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央。

雄性動(dòng)物睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的睪酮，能調(diào)控生殖細(xì)胞、器官生長(zhǎng)發(fā)育成熟，促進(jìn)精子發(fā)生，維持雄性正常生殖活動(dòng)及第二性征[9]。有研究表明，熱應(yīng)激可以抑制睪酮的生成[1]。而黃曉蘭等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠改善高溫引起的血清睪酮濃度降低，對(duì)受熱損傷的雄性大鼠生殖系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用。姜志洋等[11]發(fā)現(xiàn)日糧中添加姜黃素和槲皮素可降低夏季熱應(yīng)激對(duì)湖羊睪酮分泌的影響。本研究也發(fā)現(xiàn)GPP-L組和GPP-M組均可顯著提高血清睪酮含量，表明GPP能夠改善熱應(yīng)激引起的血清睪酮下降，對(duì)熱應(yīng)激造成的睪丸生殖生理功能受損具有一定的保護(hù)作用。

在性激素調(diào)節(jié)過程中，下丘腦-垂體-性腺軸是最直接、最主要的調(diào)控方式，睪酮通過AR介導(dǎo)從而發(fā)揮功能。馬瑞[12]研究發(fā)現(xiàn)，AR表達(dá)水平受睪酮濃度的調(diào)控，且呈時(shí)間和劑量依賴性。還有研究表明，應(yīng)激會(huì)引起AR表達(dá)水平下調(diào)[13]。由此推測(cè)，睪酮濃度下降，為了適應(yīng)睪酮濃度的變化產(chǎn)生了負(fù)反饋調(diào)節(jié)，AR蛋白表達(dá)水平下降。本研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，GPP-L和GPP-M組AR表達(dá)程度較HS組均顯著增強(qiáng)，說明GPP能夠改善熱應(yīng)激小鼠睪丸AR蛋白的表達(dá)。

Paul等[14]發(fā)現(xiàn)高溫可引起生精細(xì)胞凋亡增加，譚秋慧等[15]也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后凋亡陽性細(xì)胞明顯增多。而鄧琦等[16]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用。蔡冬寶[17]發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-O-葡萄糖及其代謝產(chǎn)物PCA均可緩解熱應(yīng)激造成的生精細(xì)胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激組凋亡細(xì)胞明顯增多，GPP組凋亡細(xì)胞有所減小，其中GPP-M組顯著減小，表明在熱應(yīng)激情況下小鼠睪丸細(xì)胞凋亡加劇，經(jīng)過GPP處理后小鼠睪丸的細(xì)胞凋亡得到一定的緩解。

MDA是眾多脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的分解產(chǎn)物，MDA的含量反映機(jī)體或組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度[18]。CAT、GSH-Px、SOD 3種酶是機(jī)體清除自由基的重要組分，三者具有協(xié)同作用，能夠清除生物體代謝產(chǎn)生的自由基和H2O2，共同組成了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶防御系統(tǒng)[19-20]。高琛等[4]發(fā)現(xiàn)腹腔注射黃芩苷能夠抑制熱應(yīng)激小鼠睪丸組織中MDA含量的升高，拮抗熱應(yīng)激引起的SOD、GSH-PX、CAT 3種酶的活力降低。曾新斌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加中劑量的牡蠣粗多糖能夠顯著提高小鼠血液中SOD和GSH-Px的活性，顯著降低MAD活性，改善了應(yīng)激狀態(tài)下小鼠的生化指標(biāo)，具有緩解熱應(yīng)激的作用。秦芹等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖能顯著降低高溫暴露大鼠睪丸組織中MDA含量，提高SOD活性，具有一定抗氧化損傷作用。本研究也發(fā)現(xiàn) GPP-M組和GPP-L組的MDA含量顯著降低，GSH-Px含量、CAT活力、SOD活力顯著升高，抗氧化酶活力恢復(fù)，提示絞股藍(lán)多糖對(duì)熱應(yīng)激引起的睪丸氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

GPP可以有效抵制熱應(yīng)激引起的睪丸組織損傷和細(xì)胞凋亡，保護(hù)AR蛋白的正常表達(dá)以及提高熱應(yīng)激小鼠睪丸抗氧化能力，其中100 mg/kg GPP效果較明顯。