陸瑞科,陳晨,高紅琴,王小雨,李少華,郝梨嵐,黃新程,關(guān)凌耀,張韻紅*

女性生殖道微生態(tài)因其對(duì)女性生殖健康的重要作用而受到日益重視,陰道內(nèi)微生物群落與宿主、環(huán)境之間相互制約、相互協(xié)調(diào),共同維系生殖道的動(dòng)態(tài)平衡。乳桿菌或乳酸桿菌一直被認(rèn)為是陰道微生物菌群的關(guān)鍵物種。這些微生物產(chǎn)生的乳酸有助于保持陰道處于pH值3.5～4.5的酸性環(huán)境,從而抵御致病微生物。臨床上能夠明確診斷病因和不明原因的女性生殖道疾病,都存在不同程度的陰道微生態(tài)失衡,包括各類陰道炎、盆腔炎、不孕、早產(chǎn)等。但是目前對(duì)于生殖道菌群與細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)的研究主要集中在育齡期女性,對(duì)于更年期以及絕經(jīng)后女性的研究比較少,同時(shí)目前基于女性生殖道微生態(tài)系統(tǒng)研究多局限于16S rRNA基因測序方法研究,采用宏基因組鳥槍法測序技術(shù)的研究非常缺乏。宏基因組鳥槍法研究能避免16S rRNA基因擴(kuò)增子測序的研究在分類學(xué)上對(duì)細(xì)菌種水平分辨率較低和缺乏物種特異性功能推斷能力的局限[1];可以從細(xì)菌、真菌、病毒等多維度描繪菌群特征。本研究擬采用宏基因組鳥槍法,探索BV與35～65歲女性下生殖道微生物的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

招募蘇州高新區(qū)2018年7月至2022年9月參與 “兩癌”篩查項(xiàng)目的女性,年齡35～65歲,現(xiàn)場充分知情告知并簽訂知情同意書者入組。采集這些志愿者的宮頸分泌物樣本、對(duì)應(yīng)的個(gè)人信息,涉及臨床診斷相關(guān)資料來自“兩癌”篩查項(xiàng)目,資料和樣本齊全者納入分析,個(gè)人信息進(jìn)行匿名處理。

從入組的女性中篩選125名BV女性為BV組,以107名健康女性作為對(duì)照組。由于研究人群是從兩癌篩查的現(xiàn)場招募,每天篩查量超過100人,故篩查現(xiàn)場對(duì)BV的診斷是臨床醫(yī)生結(jié)合臨床與實(shí)驗(yàn)室檢查情況做出的簡化診斷,具體為:① 受檢人自述有臨床癥狀,如分泌物增多、有魚腥臭味,外陰有瘙癢或燒灼感等;② 陰道分泌物異常;③ 發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞;④ 陰道黏膜無明顯異常。入組標(biāo)準(zhǔn):① 根據(jù)“兩癌”篩查對(duì)分泌物檢查的診斷結(jié)果進(jìn)行篩選,BV組女性診斷結(jié)果為BV,且未合并其他疾病,對(duì)照組女性診斷結(jié)果為正常;② BV組和對(duì)照組HPV檢查均為陰性,無HPV、CIN以及子宮頸癌既往史;③ BV組和對(duì)照組均沒有檢測出子宮肌瘤、子宮腺肌病、宮頸息肉、霉菌性陰道炎等其他疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集和處理 志愿者在進(jìn)行婦科檢查時(shí),由醫(yī)生進(jìn)行采樣,具體為使用無菌植絨拭子采集宮頸外口處的黏液,旋轉(zhuǎn)10～20圈,充分蘸取足量分泌物,將拭子頭折斷后置于裝有專用微生物保存液的保存管中,擰緊蓋后常溫保存。兩周之內(nèi)寄往實(shí)驗(yàn)室,并于-80℃冰箱保存。通過上述篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出BV組和對(duì)照組。

1.2.2 微生物基因組總DNA提取及測序 采用美基生物通用型DNA抽提試劑盒(MagPure Universal DNA KF Kit)對(duì)宮頸分泌物樣本進(jìn)行DNA提取,隨后用Qubit dsDNA HS assay kit對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行定量。將DNA樣本進(jìn)行測序文庫構(gòu)建后,通過國產(chǎn)測序平臺(tái)DIPSEQ(華大基因,深圳)進(jìn)行宏基因組鳥槍法測序(雙端測序,100 bp)。

1.2.3 物種注釋及菌群類型 對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量序列、去除人源序列以及利用MetaPhlAn3軟件進(jìn)行物種注釋。注釋結(jié)果選取種水平進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 女性陰道-宮頸菌群分布特點(diǎn)

BV組125名女性平均年齡(50±9)歲,對(duì)照組107名女性平均年齡(49±8)歲,兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過聚類方法將所有人群分成7種類型,分別為Type 1:以惰性乳桿菌(Lactobacillusiners)為主導(dǎo);Type 2:以卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)為主導(dǎo);Type 3:以加德納菌(Gardnerellavaginalis)為主導(dǎo); Type 5:以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)為主導(dǎo);Type 6:以普雷沃菌(Prevotellatimonensis)和Sneathiaamnii為主導(dǎo);Type 7:以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)為主導(dǎo);而Type 4:雜型(Diverse),為多種不同的、人群占比較少的亞型集合,即某種菌的相對(duì)豐度大于50%以上為一種亞型,且每種亞型數(shù)量都很少,包括皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)或兩岐雙岐桿菌(Bifidobacteriumbifidum)。占比相對(duì)其他幾種Type,Type 1、Type 2、Type 3主導(dǎo)菌在樣本中的相對(duì)豐度更高,菌群結(jié)構(gòu)更單一。人群中占比最多的類型是惰性乳桿菌型(Type 1),約占人群的27.16%,其次是加德納菌型(Type 3),占人群的15.09%。而卷曲乳桿菌型(Type 2),僅占人群的10.78%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于已報(bào)道的育齡女性人群的占比[2]。Type 5、6、7均屬于普雷沃菌屬主導(dǎo)的類型,其總和在人群的占比高達(dá)25%以上,遠(yuǎn)高于已報(bào)道的育齡女性的人群占比[2]。詳見圖1(彩插1)。

2.2 BV對(duì)女性陰道-宮頸菌群類型的影響

與對(duì)照組的菌群類型進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)BV組女性乳桿菌型的含量整體下降(41% vs 35%),主要由惰性乳桿菌型(Type 1)貢獻(xiàn),其在BV組比例(25%)低于對(duì)照組(30%),而卷曲乳桿菌型(Type 2)在兩組人群中占比保持一致(對(duì)照組:11%;BV組:10%)。加德納菌型(Type 3)在BV組女性的比例(19%)遠(yuǎn)高于對(duì)照組(10%)。說明相對(duì)于健康女性來說,BV女性下生殖道的乳桿菌含量下降,并伴隨著加德納菌的增加。此外,安氏普雷沃菌(P.amnii)型(Type 7)在BV組的比例高于對(duì)照組。詳見圖2,彩插1。

2.3 影響B(tài)V女性陰道-宮頸的相關(guān)菌群標(biāo)志物

在種水平上,采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的方法對(duì)BV組和對(duì)照組的陰道-宮頸菌群進(jìn)行差異性比較,尋找影響B(tài)V的相關(guān)菌群標(biāo)記物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,BV組女性陰道-宮頸部位的加德納菌(Gardnerellavaginalis)和皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)相對(duì)豐度顯著增加(Q<0.05),此外人型支原體(Mycoplasmahominis)、解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum)、安氏普雷沃菌(P.amnii)、相對(duì)豐度也有增加的趨勢(shì)(P<0.05,Q>0.05);而海氏嗜凍菌(Peptoniphilusharei)、咽峽炎鏈球菌(Streptococcusanginosusgroup)和解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)相對(duì)豐度有減少的趨勢(shì)(P<0.05,Q>0.05),詳見圖3,彩插1。

2.4 衰老對(duì)BV女性陰道-宮頸的菌群影響

為進(jìn)一步探索衰老對(duì)于BV女性陰道-宮頸菌群的影響,按年齡將人群分為4個(gè)亞組:中年對(duì)照組(<50歲;平均年齡43±4歲;55人)、中年BV組(<50歲;平均年齡42±5歲;61人)、老年對(duì)照組(≥50歲;平均年齡56±4歲;52人)、老年BV組(≥50歲;平均年齡57±4歲;64人)。中年兩亞組和老年兩亞組年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn),盡管中年BV組相對(duì)于中年對(duì)照組惰性乳桿菌型(Type 1)大幅度下降(中年對(duì)照組:44%;中年BV組:33%),但加德納菌型(Type 3)增加的并不明顯(中年對(duì)照組:2%;中年BV組:5%);而老年組則相反,乳桿菌型主要變化在卷曲乳桿菌型,在BV組沒有發(fā)現(xiàn)這種類型(老年對(duì)照組:4%;老年BV組:0),而加德納菌型(Type 3)在BV組明顯增加(老年對(duì)照組:19%;老年BV組:33%)。此外,以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)為主導(dǎo)的Type 5和以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)為主導(dǎo)的Type 7在老年BV組有明顯增加,而以多種雜型為主的Type 4大幅度減少。整體來說,相比中年組,老年組中BV對(duì)菌型影響明顯大得多。詳見圖4,彩插2。

圖5A-5B(見彩插2)分別展示了中年組、老年組影響B(tài)V的相關(guān)菌群標(biāo)記物,也再次證實(shí)了老年組中BV對(duì)菌群的影響較大,即老年組BV相關(guān)的微生物標(biāo)記物更多。老年組中,加德納菌(G.vaginalis)、人型支原體(M.hominis)和解脲支原體(U.urealyticum)等在老年BV組中顯著增加(P<0.05),而大芬戈?duì)柕戮?Finegoldiamagna)、解糖胨普雷沃菌(P.disiens)、普雷沃菌(P.timonensis)等在老年對(duì)照組中顯著富集(P<0.05)。而在中年組中,只發(fā)現(xiàn)兩個(gè)BV相關(guān)的微生物標(biāo)記物,皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒在中年BV組中富集。意外的是,加德納菌、支原體等一些常見的與BV相關(guān)菌在中年組女性中并不顯著。而年齡對(duì)乳桿菌及加德納菌的影響更大,圖5C-5D(見彩插2),結(jié)果顯示不論是健康的中年和老年女性之間,還是都患有BV的中年和老年女性之間,老年女性惰性乳桿菌(L.iners)和卷曲乳桿菌(L.crispatus)都顯著下降(P<0.05),而加德納菌(G.vaginalis)顯著增加(P<0.05)。尤其是針對(duì)BV患者,除了報(bào)道常見的BV相關(guān)菌加德納菌,還有解脲支原體(U.urealyticum)、微量需氧戴阿利斯特桿菌(Dialistermicraerophilus)、柯氣球菌(Aerococcuschristensenii)都在老年BV組中明顯富集(P<0.05,Q<0.05)。綜上所述,年齡對(duì)女性生殖道菌群影響非常大。以年齡為軸線,針對(duì)性去診斷和治療BV是很有必要的。

3 討論

陰道菌群在維持女性生殖健康上起著非常關(guān)鍵的作用。乳桿菌被認(rèn)為是維持健康女性陰道環(huán)境最重要的陰道微生物。育齡女性體內(nèi)較高的雌激素水平,使其陰道黏膜增厚,機(jī)體內(nèi)豐富的糖原或糖原水解產(chǎn)物非常有利于乳桿菌的生長。乳桿菌產(chǎn)生乳酸和細(xì)菌素,維持陰道較低的pH值,抑制有害菌的繁殖[3]。目前認(rèn)為,女性健康的陰道微生態(tài)環(huán)境是以乳桿菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),且菌群多樣性越簡單越好[4];而“不健康”的陰道菌群環(huán)境表現(xiàn)為少或無乳桿菌、多種厭氧菌共存,菌群的多樣性較高[4],這種環(huán)境極大增加了BV的感染風(fēng)險(xiǎn)。BV是全球育齡期女性普遍存在的下生殖道感染,可引起孕婦早產(chǎn)、盆腔炎、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎及增加性傳播疾病,如淋病、HIV、HPV、HSV-2等感染風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。多項(xiàng)研究已證明,BV患者的陰道菌群發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)變,即以乳桿菌為主的菌群,被大多數(shù)的兼性和嚴(yán)格厭氧菌所替代。

本研究選取的232名女性具有較大的年齡跨度(35～65歲),包含125名BV女性,平均年齡(50±9)歲,以及107名健康女性,平均年齡(49±8)歲。Ravel等[2]曾對(duì)396名來自5個(gè)種族育齡女性的陰道菌群進(jìn)行16S rRNA基因測序,將陰道菌群分成5種類型,其中4種以乳桿菌為主,分別是卷曲乳桿菌(L.crispatus)、惰性乳桿菌(L.iners)、加氏乳桿菌(L.gasseri)和詹氏乳桿菌(L.jensenii),第5種是以少乳桿菌,高比例的厭氧菌為主,包括加德納菌(G.vaginalis)、陰道阿托波氏菌(Atopobiumvaginae)等。Jie等[8]通過對(duì)516名平均年齡在30歲的健康中國女性陰道菌群的宏基因組研究,發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌型、惰性乳桿菌型以及加德納菌型是人群中最為主要的類型,分別占人群的24.61%、22.67%以及19.19%。在本研究中,不論健康人群還是BV人群,以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的類型大大降低,僅占人群的10.78%左右。而惰性乳桿菌型的含量有所增加,尤其是對(duì)照組女性,在人群中比例占到30%。加德納菌是感染BV發(fā)生的關(guān)鍵菌,加德納菌會(huì)分泌毒性因子并黏附在宿主的上皮細(xì)胞,形成生物膜菌落,將乳桿菌在陰道環(huán)境中的生態(tài)位競爭掉[9]。在本研究中,對(duì)照組健康人群和BV組人群中加德納菌型也存在顯著差異(10% vs 19%)。除此之外,與既往報(bào)道的研究一致[10],人型支原體(M.hominis)、解脲支原體(U.urealyticum)也顯示在BV女性中富集。

目前對(duì)于陰道菌群的研究多集中在育齡女性,對(duì)于進(jìn)入圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)期的女性,研究非常有限。隨著女性年齡的增大,雌激素水平大大降低,特別是進(jìn)入圍絕經(jīng)期后,女性雌激素水平更是呈斷崖式下降。匱乏的雌激素水平很難為乳桿菌提供充足的糖原。因此,進(jìn)入這一階段的女性,乳桿菌基本上不再是陰道的優(yōu)勢(shì)菌,陰道菌群由育齡期較單一的菌群結(jié)構(gòu)變?yōu)槎鄻有愿叩木航Y(jié)構(gòu)。在陰道菌群變化如此巨大的時(shí)候,BV對(duì)陰道菌群有何影響還有待進(jìn)一步研究。

因此,本研究按50歲為界限,將人群分為中年組和老年組,分別比較了BV對(duì)不同年齡陰道菌群的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BV對(duì)老年組女性陰道菌群影響更大。前面提到的加德納菌(G.vaginalis)、人型支原體(M.hominis)、解脲支原體(U.urealyticum)等BV相關(guān)的常見微生物標(biāo)記物在老年組存在顯著差異。但這些標(biāo)記物在中年組都不顯著,只有皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒顯示在中年BV組中富集。此外,老年BV患者相對(duì)中年BV患者,加德納菌(G.vaginalis)、解脲支原體(U.urealyticum)等更容易富集,也提示隨著年齡增加,BV對(duì)陰道菌群的影響可能也更加復(fù)雜。

此外,本研究在BV的診斷上存在一定的局限性。目前臨床上的金標(biāo)準(zhǔn)為Amsel法,即包含:① 鏡檢下有線索細(xì)胞;② 分泌物異常;③ 陰道pH>4.5;④ 胺試驗(yàn)陽性(有魚腥臭味),滿足上述4條中的3條,即可診斷為BV。由于本研究的人群是從蘇州兩癌篩查的現(xiàn)場招募,現(xiàn)場每天的篩查量超過100人。大人群量篩查和檢測很難完全遵從嚴(yán)格的Amsel標(biāo)準(zhǔn)。篩查現(xiàn)場對(duì)BV的診斷是臨床醫(yī)生結(jié)合臨床與實(shí)驗(yàn)室檢查情況做出的簡化診斷,具體為:① 受檢人自述有臨床癥狀,如分泌物增多、有魚腥臭味,有外陰瘙癢或燒灼感等;② 陰道分泌物異常;③ 發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞;④ 陰道黏膜無明顯異常。因有相當(dāng)一部分BV患者為無癥狀患者,臨床治療BV的指征之一是有BV癥狀,第1點(diǎn)對(duì)于篩出有癥狀的BV很有必要;而第2～3點(diǎn)是Amsel標(biāo)準(zhǔn)中的其中兩條,陰道分泌物一般由臨床醫(yī)生肉眼觀察,分泌物是否灰白色,均質(zhì)、稀薄特征,是否常黏附于陰道壁,容易將分泌物從陰道壁拭去;線索細(xì)胞是通過高倍鏡進(jìn)行觀察,鏡檢下見到陰道上皮細(xì)胞邊緣呈顆粒狀或點(diǎn)狀桿菌聚集即為線索細(xì)胞,它是BV最敏感最特異的體征之一。第4點(diǎn)也是由臨床醫(yī)生肉眼觀察,一般需要陰道黏膜無充血的炎癥表現(xiàn),且無出血點(diǎn),來排除合并其他陰道炎癥的患者。綜上所述,盡管本研究存在大樣本人群檢測的局限性,對(duì)BV的臨床診斷僅包含了Amsel金標(biāo)準(zhǔn)中的其中兩條,但自述臨床癥狀也是篩選有癥狀BV的有利手段,從臨床角度來看,本研究的診斷方法有較高的檢出率,對(duì)于BV的診斷也有一定的臨床意義。

本研究通過宏基因組鳥槍法描述了35～65歲女性的下生殖道菌群結(jié)構(gòu),構(gòu)建出中國蘇州大齡女性的陰道微生物圖譜。同時(shí),通過分年齡段對(duì)BV女性和健康女性的陰道菌群進(jìn)行比較,分別找出了中年和老年女性BV相關(guān)的菌群標(biāo)志物,為后續(xù)以年齡為軸線,針對(duì)性進(jìn)行BV的診斷、治療提供了重要的參考依據(jù)。

致謝:感謝深圳華大生命科學(xué)研究院(深圳國家基因庫)為本研究提供的樣本存儲(chǔ)、提取、測序等支持。