羅蘭,陳能輝,吉明明,黃木蘭,潘章穎

(贛州市婦幼保健院,江西 贛州 341000)

自身免疫性腦炎(autoimmune encephalitis,AE)是一種由免疫系統(tǒng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原的異常免疫反應(yīng)引起的炎癥性疾病;該病特點(diǎn)為急性或亞急性起病,臨床主要表現(xiàn)為異常的精神行為、認(rèn)知功能障礙等。它的病程很長,很容易復(fù)發(fā),無特異性好發(fā)人群有些兒童可能有嚴(yán)重殘疾甚至死亡,而且死亡率高達(dá)80%,早期診斷和早期干預(yù)能有效改善預(yù)后[1],常用腦脊液、影像學(xué)MRI、腦電圖檢查。有文章指出,AE再鬧嚴(yán)重的比例為21%,其中抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)腦炎在AE中的占比約為80%,[2]現(xiàn)居腦炎第3位。其在腦血管內(nèi)廣泛分布,作為興奮性谷氨酸鹽神經(jīng)遞質(zhì)的受體,與突觸可塑性、神經(jīng)元突觸傳遞、記憶力、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等方面密切相關(guān)。也就是說,抗NMDA受體腦炎就是機(jī)體產(chǎn)生了針對NMDA受體的抗體,擾亂了其正常的生理功能,從而在臨床上表現(xiàn)出腦炎的癥狀。該病會對大腦以及大腦邊緣系統(tǒng)都會造成不同程度的損傷,其中該病最常見的類型是抗NMDAR腦炎,會存在精神行為異常、記憶力下降及語言障礙等臨床癥狀,部分患者還會存在反復(fù)抽搐[3]。目前該病的治療主要分為一線和二線免疫治療,治療安全性較好,但是該病早期癥狀復(fù)雜多樣,所以臨床漏診率較高[4]。臨床上根據(jù)該病病情的不同程度分為了前驅(qū)期、精神癥狀及癲癇發(fā)作期、無反應(yīng)期、不自主運(yùn)動(dòng)期、恢復(fù)期,但是某些患兒也難以明確界定分期。miR-146a、miR-146b可參與免疫反應(yīng)等,可能與病毒性腦炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5]。如果病毒性腦炎發(fā)病,就會直接導(dǎo)致存在于腦血管中的外皮細(xì)胞的T細(xì)胞和初級T細(xì)胞迅速減少,而miR-146a、miR-146b水平升高,將會致使機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力失去平衡進(jìn)而影響到血-腦屏障的保護(hù)功能和血液中T淋巴細(xì)胞的免疫功能。miR-146a和miR-146b表達(dá)水平與機(jī)體的免疫功能呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),可用于反映機(jī)體的免疫功能。病毒感染后,機(jī)體內(nèi)miR-146a、miR-146b水平過高可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和生長,導(dǎo)致病情加重,并且二者還可引發(fā)代償性炎性反應(yīng),進(jìn)而影響免疫應(yīng)答反應(yīng),并使得患者預(yù)后受到影響,進(jìn)而病情更加嚴(yán)重。因此。多項(xiàng)研究認(rèn)為人類的大多數(shù)疾病與外周血中miR-146a、miR-146b有著緊密關(guān)聯(lián),所以miR-146a、miR-146b可以作為反映機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫功能的依據(jù),可能與病毒性腦炎的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),但是相關(guān)研究較少[6-7]。但是該病對家庭及社會的影響較大,所以早發(fā)現(xiàn)早治療顯得尤為重要。因此本研究重點(diǎn)分析miR-146a和miR-146b在兒童抗NMDAR腦炎診斷中臨床意義,探討其潛在診斷與預(yù)后新型標(biāo)志物的可能性和必要性,為兒童NMDAR腦炎診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取30例確診為NMDAR腦炎兒童作為研究對象。其中男19例,女11例;年齡平均(6.47±1.43)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床表現(xiàn)與體征符合《兒童自身免疫性腦炎診斷指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②初診患兒;③年齡在2-10歲間的兒童;④予以對癥治療,且有完整的資料信息。⑤血清或者腦脊液抗NMDAR抗體呈陽性。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有其他自身免疫抗體陽性腦炎;②合并有代謝性或中毒性的腦部疾病者;③合并有其他的神經(jīng)系統(tǒng)退化和遺傳疾病;④家屬或監(jiān)護(hù)人不同意參與本研究觀察者。

1.2 方法

1.2.1 主要治療方案

①一線免疫治療:以大劑量激素沖擊聯(lián)合靜脈免疫球蛋白(IVIg)為主;②二線免疫治療:采用利妥昔單抗治療;③三是長程的免疫維持治療:對于反復(fù)發(fā)作以及經(jīng)一線治療療效欠佳的患兒。

1.2.2 標(biāo)本獲取與預(yù)處理方法

分別于患兒入院診斷時(shí)和穩(wěn)定康復(fù)出院前采集空腹靜脈血和腦脊液標(biāo)本,靜脈血經(jīng)2000—2500 rpm離心1—2 min,提取上層透明部分,采用無菌無酶500l塑料EP管分裝,將上述標(biāo)本保存在-20℃冰箱中,備檢測。

1.2.3 RT-qPCR檢測方法

采用血清/腦脊液microRNA提取試劑盒提取miRNA,按照說明書嚴(yán)格操作,首先進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄為cDNA;采用實(shí)時(shí)RT-qPCR檢測miR-146a和miR-146b相對表達(dá)量。

1.2.4 臨床療效觀察

預(yù)后評估采用改良Rankin量表(mRS)評價(jià)患者神經(jīng)功能,0～2分為預(yù)后良好,3～6分為預(yù)后不良或死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察兩組患兒臨床資料:兩組患兒臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05,見表1。

表1 兩組患兒臨床資料比較

2.2 觀察兩組患兒miR-146a水平:入院時(shí)兩組患兒外周血和腦脊液miR-146a表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146a表達(dá)較低,P<0.05,見表2。

表2 兩組患兒miR-146a表達(dá)比較

2.3 觀察兩組患兒miR-146b水平:入院時(shí)兩組患兒外周血和腦脊液miR-146b表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146b表達(dá)較低,P<0.05,見表3。

表3 兩組患兒miR-146b表達(dá)比較

2.4 觀察兩組患兒臨床療效:觀察組療效較對照組較好,P<0.05,見表4。

表4 兩組臨床療效比較

3 討論

自身免疫性腦炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病,主要與自身免疫反應(yīng)有關(guān),中樞系統(tǒng)自身抗原被誤認(rèn)為外來抗原受到攻擊,產(chǎn)生自身特異性抗體,引起的腦炎,有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞表面抗原抗體主要由體液免疫介導(dǎo),細(xì)胞內(nèi)抗原抗體主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo),但也有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)體亦參與致病過程,副腫瘤性自身免疫性腦炎發(fā)病原因可能是腫瘤組織表達(dá)的抗原與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元表達(dá)的抗原相似,而腫瘤抗原激發(fā)了機(jī)體的免疫應(yīng)答保護(hù)機(jī)制,導(dǎo)致攻擊腫瘤抗原的抗體與神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)抗原的神經(jīng)元發(fā)生反應(yīng),損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng),產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。前驅(qū)期癥狀臨床表現(xiàn)類似于病毒感染,出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、乏力、嘔吐、腹瀉等癥狀。并發(fā)癥:嗜睡:主要表現(xiàn)為嗜睡、睡眠覺醒周期紊亂和白天過度睡眠等。意識障礙:癥狀嚴(yán)重者一般會出現(xiàn)意識障礙、休克,甚至?xí)霈F(xiàn)休克等癥狀。通氣不足:較常見,患者會表現(xiàn)為通氣不足,呼吸不上來,呼吸不暢等癥狀,有些患者甚至需要呼吸機(jī)輔助呼吸。

自身免疫性腦炎是臨床上十分常見的一類腦膜炎癥,發(fā)病原因是當(dāng)機(jī)體的免疫力低下時(shí),病毒會侵犯人的神經(jīng),對其組織及細(xì)胞造成傷害,致使機(jī)體釋放炎性因子,而兒童是這類疾病發(fā)病最高的人群[9]。該病發(fā)病后會出現(xiàn)腦膜受激惹后存在的部分臨床癥狀,其最常見的首發(fā)癥狀是精神行為異常,甚至?xí)霈F(xiàn)癲癇、驚厥。病情發(fā)展迅速,如果不及時(shí)治療,很容易導(dǎo)致殘疾和死亡[10]。臨床上指出腦脊液病毒分離是病毒性腦炎診斷金標(biāo)準(zhǔn),但耗時(shí)較長、對實(shí)驗(yàn)室條件要求高,臨床的應(yīng)用受到了一定的限制,會延誤病情,所以尋找一類快速便捷準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)對該病的診斷和評估十分重要。

miRNA是一類可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小分子非編碼RNA,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。miR-146a、miR-146b與人類多種疾病密切相關(guān),但是相關(guān)研究不多,因此本研究為探討其潛在診斷做出以下探討。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小長約20～25個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的,隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體,通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA,并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。具有增強(qiáng)細(xì)胞增值和分化,新陳代謝,癌癥以及自身免疫等,因此在大多數(shù)生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。截至目前為止miRNA的生物學(xué)功能只有一小部分得到了闡明。生命過程中發(fā)育、疾病與這些miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,組織分化有關(guān)。通過對基因組上miRNA的位點(diǎn)分析,顯示其在發(fā)育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明:在血細(xì)胞分化,細(xì)胞發(fā)育和凋亡,大腦組織形成,神經(jīng)元極性,同源異形盒基因調(diào)節(jié),胰島素分泌,心臟功能發(fā)生,胚胎后期發(fā)育等過程中miRNA發(fā)揮著關(guān)鍵作用。另外許多神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA被研究人員發(fā)現(xiàn)其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯,表明其在大腦皮層的培養(yǎng)中受到時(shí)序調(diào)節(jié)。對于新的基因的分析,miRNA新的發(fā)現(xiàn)可能會促進(jìn)人類對癌癥等疾病發(fā)病機(jī)制的理解并參與器官形成、胚胎發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)因子。miR-146a在固有免疫TLR信號通路中起到負(fù)調(diào)的作用,是因?yàn)樵诹馨图?xì)胞中,miR-146a可以抑制脂多糖誘導(dǎo)NO生成。miRNA沉默或降解目標(biāo)mRNA還可以通過互補(bǔ)結(jié)合對免疫信號傳導(dǎo)起到反饋調(diào)節(jié)作用。miRNA調(diào)控多種機(jī)體生物學(xué)功能,與其對應(yīng)的靶基因結(jié)合,轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá),但是,與靶基因結(jié)合位點(diǎn)及其作用方式、Dicer酶剪切位點(diǎn)等[13]因素都會影響miRNA對靶基因的調(diào)控。研究人員發(fā)現(xiàn)幾個(gè)甚至幾百個(gè)靶基因會被一種或幾種miRNA控制,但是一些miRNA也會同時(shí)調(diào)控[14]部分靶基因。近幾年來曾經(jīng)有多項(xiàng)研究[15]表明,包含淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞在內(nèi)等多種免疫細(xì)胞主要在機(jī)體抵抗病原體時(shí)受到侵襲,病毒感染、及時(shí)清理突變細(xì)胞以及維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)炎癥刺激機(jī)體時(shí),病毒性腦炎機(jī)體中的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及眾多免疫細(xì)胞中的miR-146a、miR-146b被激活,會加快促進(jìn)和誘導(dǎo)炎性反應(yīng),還可影響機(jī)體免疫[16]抑制核因子(NF)-κB的活化。由于宿主細(xì)胞可受到感染刺激產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),加重病情[17],因此其水平與病情相關(guān)而且miR-146a、miR-146b可引起機(jī)體代償性炎性反應(yīng)[18]。研究結(jié)論表明,觀察組出院前患兒外周血和腦脊液miR-146a、miR-146b水平表達(dá)均優(yōu)于入院時(shí),提示病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b表達(dá)水平升高。

在本文研究中,首先對兩組患兒的臨床資料進(jìn)行了比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果說明了兩組患兒具有可比性,且結(jié)果準(zhǔn)確性較高。研究認(rèn)為腦脊液是一種重要的新型機(jī)制,它不僅僅可以包裹氨基酸,還可以包裹miRNA,在各種生物條件下形成并釋放它們,然后進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控[19-20]。因此本研究對腦脊液和外周血中miR-146a與miR-146b的表達(dá)進(jìn)行檢測分析其診斷意義。結(jié)果顯示入院時(shí)兩組患兒外周血和腦脊液兩種miRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,出院前觀察組患兒外周血和腦脊液miR-146a、miR-146b表達(dá)較低。這說明當(dāng)機(jī)體受到病毒侵害,釋放炎性因子時(shí),miR-146a、miR-146b會被激活,誘發(fā)免疫應(yīng)激,從而參與抗NMDAR腦炎的發(fā)生,說明其會誘導(dǎo)和促進(jìn)炎性反應(yīng)?？筃MDAR抗體腦炎患兒在幾天到幾周內(nèi)分階段發(fā)展,通常從病毒前驅(qū)感染癥狀開始,大約50%的抗NMDAR抗體腦炎患兒有病毒感染前驅(qū)癥狀,包括發(fā)熱、頭痛、胃腸道癥狀或上呼吸道感染癥狀此后可表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀,如癲癇發(fā)作或運(yùn)動(dòng)障礙,而并不是成年人常見的精神癥狀。此外,本研究還針對患兒兩種治療方式的療效進(jìn)行分析,結(jié)果顯示觀察組療效較對照組較好,說明聯(lián)合利妥昔單抗治療效果優(yōu)于糖皮質(zhì)激素和免疫球蛋白治療。而出院前觀察組miR-146a、miR-146b表達(dá)比對照組更低,因此更進(jìn)一步說明miR-146a與miR-146b可以反映機(jī)體的炎性反應(yīng)情況和免疫功能,說明miR-146a與miR-146b是該病潛在標(biāo)志物。還有研究指出該病機(jī)體內(nèi)的白細(xì)淋巴細(xì)胞、巨噬等各種細(xì)胞在干預(yù)下產(chǎn)生炎性介質(zhì),進(jìn)而會進(jìn)一步使疾病更加嚴(yán)重,認(rèn)為miR-146a和miR-146b會引起代償性炎癥反應(yīng),可以監(jiān)測該病病情[21-22]。但本研究并未針對病情進(jìn)行分析。雖然抗NMDA受體腦炎治療的效果較好,但是通常會復(fù)發(fā),需要長期隨訪。另外,自身免疫性腦炎容易并發(fā)其他自身免疫性疾病,需要在患者成年后注意。此外,臨床中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自身免疫性腦炎臨床癥狀控制后才發(fā)現(xiàn)患者合并腫瘤的情況,因此自身免疫性腦炎患者需要遵從醫(yī)囑,定期隨訪。

綜上所述,兒童抗NMDAR腦炎miR-146a與miR-146b表達(dá)較高,說明兩者是該病的潛在生物標(biāo)志物,臨床上可以通過監(jiān)測其表達(dá)為臨床防治提高一定的措施,但是其作為參考指標(biāo),對該病的臨床價(jià)值還需進(jìn)一步分析。外周血miR-146a、miR-146b參與NMDAR腦炎的發(fā)病及發(fā)展過程,可以作為反映NMDAR腦炎患兒病情和機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo),且二者水平越高患兒預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)很可能也越高。本研究的不足在于病例少等限制所選樣本量稍少、受病毒類型檢驗(yàn)難度大,或許對結(jié)果的準(zhǔn)確性造成一定的偏移,也并未分析其與疾病病情的相關(guān)性,后續(xù)還需進(jìn)一步研究并加大樣本量。