趙東方，尉志強，邢姝琴，祁 姣，黃江海，溫鑫柱，王亞非

(1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院骨科,北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院腫瘤科,北京 100078;3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院經(jīng)開院區(qū)門診護理部,北京 100176)

骨關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨損害為主的關節(jié)疾病,其特征為關節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生,隨著疾病的發(fā)展,最終造成整個關節(jié)面的損害[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學尚不能完全解釋骨關節(jié)炎的發(fā)病機制,但研究表明其與環(huán)境刺激、免疫功能、內(nèi)分泌、藥物使用等多種因素有關[2-3]。目前,臨床上對于骨關節(jié)炎的治療主要以手術(shù)及藥物治療為主,其中手術(shù)治療主要針對重度骨關節(jié)炎患者[4],對于輕中度骨關節(jié)炎患者的治療,主要通過藥物達到抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛、恢復關節(jié)功能的治療效果[5]。研究表明,長期使用骨關節(jié)炎治療藥物容易導致患者機體多系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應[6],因此,不良反應較低的中藥治療日益受到臨床關注。巴戟天是茜草科巴戟天屬植物巴戟天的干燥根,現(xiàn)代藥理學研究表明,巴戟天具有抗抑郁、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、防治阿爾茲海默癥、改善生殖、保護心腦血管等諸多功效[7],但目前國內(nèi)對于其在骨關節(jié)炎治療方面的研究尚屬空白。有研究報道,臨床骨關節(jié)炎患者外周血中炎癥因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β的表達異常。而近期一項關于骨關節(jié)炎的實驗研究表明,IL-1β與軟骨細胞凋亡水平密切相關[8]。另有研究表明,骨關節(jié)炎疾病發(fā)展程度越高,其軟骨細胞自噬水平越低[9]。因此,與自噬及凋亡相關的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路在骨關節(jié)炎的發(fā)展及治療過程中是否發(fā)揮作用值得深入研究。基于此,本研究建立骨關節(jié)炎小鼠模型,探討巴戟天對骨關節(jié)炎小鼠軟骨細胞凋亡、自噬的影響及可能機制,以期為巴戟天治療骨關節(jié)炎的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12周齡健康C57BL/6雄性小鼠40只,體質(zhì)量(24±2)g,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(動物許可證號:44007200041000),標準飼養(yǎng)于室溫25 ℃、相對濕度(40±2)%、每日12 h/12 h明暗交替的清潔級動物房中,適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器

含吐溫的Tris緩沖生理鹽水(Tris-buffered saline and tween-20,TBST)、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,巴戟天生藥購自杭州鼎好科技有限公司,自噬效應蛋白1(Beclin1)、人微管相關蛋白輕鏈3B(human microtubule-associated protein light chain,LC3B)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-Akt)、抗體及二抗購自美國Abcam生物技術(shù)有限公司,內(nèi)參β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色試劑盒、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒、蛋白提取試劑盒購自北京利維寧生物科技有限公司,RT-PCR引物由上海賽默飛世爾(中國)有限公司合成,凋亡試劑盒及蛋白標記物購自南京良緯科技有限公司;Western blot 凝膠電泳儀購自北京六一儀器廠,JP-K300顯影儀購自上海嘉鵬科技有限公司,RT-PCR儀和Transwell小室購自美國Thermo Fisher Scientific公司,流式細胞儀購自美國BD公司,高速離心機購自日本日立公司,細胞孵育箱購自上海川宏實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及處理

將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組和低、中、高劑量巴戟天組,每組8只。參照鐘宇辰等[10]方法制備小鼠骨關節(jié)炎模型:模型組和低、中、高劑量巴戟天組小鼠給予戊巴比妥鈉麻醉后剔除右側(cè)膝關節(jié)處毛發(fā),將 0.2 mg 碘乙酸溶于10 μL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中注入膝關節(jié)腔;隨后,模型組小鼠每日給予1 mL生理鹽水灌胃,低、中、高劑量巴戟天組小鼠每日分別將100、200、400 mg·kg-1巴戟天溶于1 mL生理鹽水灌胃,均持續(xù)4周;對照組小鼠制備骨關節(jié)炎假模型:給予戊巴比妥鈉麻醉后剔除右側(cè)膝關節(jié)處毛發(fā),將10 μL PBS注入膝關節(jié)腔,隨后每日給予1 mL生理鹽水灌胃,持續(xù)4周。4周后處死所有小鼠,收集各組小鼠右側(cè)膝關節(jié)組織,斷離周圍肌肉組織,無菌條件下從肱骨、股骨遠端和脛骨近端關節(jié)面切取軟骨,分為2部分,分別用于組織包埋和提取軟骨細胞。

1.3.2 各組小鼠軟骨細胞懸液的制備

將各組小鼠擬提取軟骨細胞的軟骨剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊,用D-Hanks液沖洗3次,將軟骨組織塊移入50 mL消化小瓶內(nèi),加入2.5 g·L-1胰蛋白酶 6 mL,于37 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化30 min,于消化小瓶內(nèi)加入6 mL用DMEM配制的2型膠原酶(2 g·L-1),于37 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化3次,每次60 min,將每次消化所得軟骨細胞懸液稍作吹打,收集于離心管中,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,1 000 r·min-1離心5 min后棄上清,用DMEM洗滌2次,最后加入5 mL軟骨細胞培養(yǎng)基配成軟骨細胞懸液。

1.3.3 TUNEL染色檢測各組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率

將各組小鼠右膝關節(jié)軟骨組織固定包埋并切片;二甲苯Ⅰ脫蠟10 min,二甲苯Ⅱ脫蠟2次、每次10 min;脫蠟至蒸餾水浸泡漂洗,加入蛋白酶K工作液(蛋白酶K原液PBS=19),37 ℃溫箱孵育22 min,PBS晃動洗滌3次,每次5 min;切片稍甩干后滴加破膜工作液(triron原液PBS=11 000),常溫孵育20 min,PBS晃動洗滌3次,每次5 min;切片稍甩干后滴加Buffer,常溫孵育10 min;切片稍甩干后滴加反應液(TDT酶dUTPBuffer=1550),濕盒內(nèi)37 ℃溫箱孵育2 h。洗滌3次后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染液,避光室溫孵育10 min,PBS晃動洗滌3次,每次5 min。切片稍甩干后圈內(nèi)滴加抗熒光淬滅封片劑封片。每張切片于熒光顯微鏡下隨機選取5個視野拍照觀察,觀察細胞凋亡情況:每例切片計數(shù)5個200倍視野,以每個視野中凋亡細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分率計算凋亡率。實驗重復3次,取均值。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡情況

取配置好的軟骨細胞懸液5 mL,用冰上預冷10 min的體積分數(shù)70%乙醇固定2 h后棄上清液,調(diào)整細胞濃度為1×109L-1,加入流式管中,根據(jù)細胞凋亡試劑盒說明書,加入5 μL的Annxin V和5 μL溴化乙錠,震蕩混勻,在37 ℃恒溫孵育箱中避光恒溫孵育,25～30 min后用200目細胞濾網(wǎng)過濾,避免細胞成團,然后轉(zhuǎn)移至流式管中,應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次,取均值。

1.3.5 Western blot法檢測各組小鼠軟骨細胞懸液中p-Akt、p-PI3K、Beclin1、LC3B蛋白表達

取軟骨細胞懸液5 mL,加入400 μL蛋白裂解液,冰上裂解10 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,置于EP管中,加入十二烷基磺酸鈉混勻,置于沸水中水煮5 min變性。將蛋白樣本進行上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST清洗3次,隨后加入含有p-Akt(11 000)、p-PI3K(11 000)、Beclin1(11 000)、LC3B(11 000)及β-actin(1500)一抗溶液的孵育盒中,4 ℃封閉過夜;TBST清洗3次后加入相對應二抗,37 ℃封閉1 h,洗膜,將化學發(fā)光顯影液均勻涂在膜上反應2 min,用濾紙吸去多余的底物液,通過蛋白顯影儀拍照,應用Image J軟件分析目的蛋白的灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 RT-PCR法檢測各組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA的表達

取配置好的軟骨細胞懸液5 mL置于EP管,向其中加入1 mL TRIzol試劑,冰上孵育5～10 min,加入預冷的氯仿0.2 mL,繼續(xù)冰上孵育5 min后,1 200 r·min-1離心15 min,轉(zhuǎn)移水相,加入等體積異丙醇后再次離心10 min,棄上清液,加預冷的體積分數(shù)75%乙醇洗滌,棄上清后風干,加入100 μL的無酶水溶解制得總RNA備用;根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將制備好的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后按照RT-PCR試劑盒說明書的操作步驟加入SYBR Green染料及p-PI3K、p-Akt及β-actin上、下游引物,混合離心,于PCR儀上進行擴增,反應程序: 94 ℃ 預 變 性 5 min;94 ℃變性25 s,62 ℃退火40 s,70 ℃延伸60 s,重復 30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。p-PI3K上游引物序列為5′-GACTTGTCATTCACTCTACCG-3′,下游引物序列為5′-TGAGTAGGACCACAGTGCCA-3′;p-Akt上游引物序列為5′-GAGGTGTTAGAACCACGCCA-3′,下游引物序列為5′-TCAATCAGCAGCAGGAAT-3′;β-actin上游引物序列為5′-TCACGGTATGTCAACTCGCAAT-3′,下游引物序列為5′-AAGAGTAACGAGAAGTAAGCA-3′。延伸完成后作溶解曲線,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復 3次,取均值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率比較

對照組、模型組以及低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率分別為(2.46±0.17)%、(42.10±7.57)%、(28.47±3.69)%、(22.90±2.58)%、(8.63±1.24)%。模型組和低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡率顯著低于低劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量巴戟天組軟骨組織中軟骨細胞凋亡率顯著低于中劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

A:對照組;B:模型組;C:低劑量巴戟天組;D:中劑量巴戟天組;E:高劑量巴戟天組。

2.2 5組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率比較

對照組、模型組以及低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率分別為(14.42±1.53)%、(72.10±12.08)%、(50.47±12.90)%、(33.84±5.21)%、(26.60±3.47)%。模型組和低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于低劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于中劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

A:對照組;B:模型組;C:低劑量巴戟天組;D:中劑量巴戟天組;E:高劑量巴戟天組。

2.3 5組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-Akt、p-PI3K蛋白表達比較

模型組和低、中劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高劑量巴戟天組與對照組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量顯著高于低劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量顯著高于中劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表1和圖3。

表1 5組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量比較Tab.1 Comparison of relative expression levels of Beclin1,LC3B,p-PI3K and p-Akt protein in chondrocytes suspension of mice among the five groups

A:對照組;B:模型組;C:低劑量巴戟天組;D:中劑量巴戟天組;E:高劑量巴戟天組。

2.4 5組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量比較

模型組和低、中劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高劑量巴戟天組與對照組軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低、中、高劑量巴戟天組軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量高于低劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量巴戟天組軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著高于中劑量巴戟天組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 5組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量比較Tab.2 Comparison of the relative expression levels of p-PI3K and p-Akt mRNA in chondrocytes suspension of mice among the five groups

3 討論

骨關節(jié)炎是骨科臨床常見關節(jié)病,目前尚難早期發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎患者骨關節(jié)中的生物學改變[11]。巴戟天是茜草科巴戟天屬植物巴戟天的干燥根,在中醫(yī)臨床尤其是在抗炎治療中得到了廣泛應用[12]。研究顯示,巴戟天提取物能呈劑量依賴性抑制促炎介質(zhì)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、IL-1β、IL-6的表達,降低誘導型一氧化氮合酶蛋白表達并抑制核因子κB核轉(zhuǎn)位,這些促炎因子往往在骨關節(jié)炎患者外周血呈高表達狀態(tài),是骨關節(jié)炎疾病進展的關鍵因子[13],因此,巴戟天有可能在骨關節(jié)炎的治療中發(fā)揮一定作用。在骨關節(jié)炎的疾病惡化過程中,骨關節(jié)軟骨細胞凋亡、自噬可能是影響疾病發(fā)展的關鍵生物學進程。因此,本研究通過建立骨關節(jié)炎小鼠模型,觀察巴戟天對軟骨細胞凋亡、自噬及其相關信號通路的影響,探討巴戟天治療骨關節(jié)炎的效果及其可能機制。

在發(fā)生骨關節(jié)炎時,軟骨細胞會受到趨化因子CXC家族、IL-1、腫瘤壞死因子-α等多種炎癥因子等的刺激[14],激活一氧化氮信號通路、死亡受體信號通路及PI3K/Akt信號通路多種途徑參與骨關節(jié)炎發(fā)病過程[15-17]。其中,PI3K/Akt信號通路在影響軟骨細胞的凋亡及自噬的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。研究表明,當機體內(nèi)炎癥因子大量聚集,會導致PI3K/Akt信號通路被抑制,同時軟骨細胞的凋亡水平顯著增加[18]。因此,PI3K/Akt信號通路穩(wěn)定與否與骨關節(jié)炎的病理發(fā)展密切相關,維持PI3K/Akt信號通路的穩(wěn)定可以有效阻止骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠軟骨組織及軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率均顯著增高,同時,模型組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著低于對照組,提示骨關節(jié)炎小鼠軟骨細胞中PI3K/Akt信號通路表達被顯著抑制,從而促進細胞凋亡;而低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織及軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于模型組,中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織及軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于低劑量巴戟天組,高劑量巴戟天組小鼠軟骨組織及軟骨細胞懸液中軟骨細胞凋亡率顯著低于中劑量巴戟天組,結(jié)果顯示,經(jīng)過巴戟天干預后,骨關節(jié)炎小鼠軟骨組織中軟骨細胞凋亡被顯著抑制,且存在劑量依賴性;同時,低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著高于模型組,中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著高于低劑量巴戟天組,高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著高于中劑量巴戟天組,高劑量巴戟天組與對照組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義;提示,巴戟天干預激活了PI3K/Akt信號通路,使骨關節(jié)炎小鼠軟骨細胞中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量及p-PI3K、p-Akt mRNA相對表達量顯著上調(diào),且存在劑量依賴性。

PI3K被激活后會募集和激活下游信號分子Akt使其磷酸化水平增加,Akt被PI3K 激活后會促使下游炎癥因子的活化,這些磷酸化底物活化后會促進細胞的自噬[19],在這一過程中下游自噬相關基因Beclin1及LC3B的表達往往會呈顯著上升趨勢。Beclin1 是自噬的關鍵調(diào)節(jié)因子,可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3磷酸的生成并協(xié)調(diào)自噬體的形成來控制自噬過程[20]。自噬的激活可伴隨 Beclin1上調(diào)及溶酶體活性增加[21]。LC3B被認為是哺乳動物的自噬體標志物,也是檢測自噬激活最常用的標志物,其可與自噬小體外膜緊密結(jié)合,并在溶酶體中被轉(zhuǎn)運和降解,其含量與自噬泡的數(shù)量呈正相關[22]。在自噬過程中,自噬體包裹受損細胞器并與溶酶體結(jié)合,形成自噬溶酶體,此時LC3B將與自噬體膜相解離[23]。當自噬過程被抑制,LC3B 及 Beclin1 的表達會明顯下調(diào)[24]。本研究結(jié)果顯示,與對照組鼠相比,模型組小鼠軟骨細胞懸液中自噬相關基因Beclin1、LC3B 的蛋白表達顯著降低,提示細胞自噬水平降低;而給予巴戟天干預后,低、中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B蛋白相對表達量顯著高于模型組,中、高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B蛋白相對表達量顯著高于低劑量巴戟天組,高劑量巴戟天組小鼠軟骨細胞懸液中Beclin1、LC3B蛋白相對表達量顯著高于中劑量巴戟天組;提示巴戟天干預可增加骨關節(jié)炎小鼠軟骨細胞的自噬水平,且與巴戟天濃度存在劑量依賴性。

4 結(jié)論

巴戟天能促進骨關節(jié)炎小鼠軟骨細胞的自噬,抑制軟骨細胞凋亡,從而減輕骨關節(jié)炎的發(fā)展;其藥理學作用可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路而實現(xiàn)的,巴戟天有可能作為骨關節(jié)炎的臨床治療藥物。