張文麗， 王 英， 石 瑩， 呼鑫榮， 旭日花

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010021）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一種高G+C 含量的厭氧革蘭氏陽性桿狀菌，屬放線菌門[1]，1899 年由Tissier 首次從嬰兒糞便中分離得到[2]。作為人出生后腸道內(nèi)最早的細(xì)菌定植者之一[3]，其數(shù)量和組成隨時間和年齡而變化[4-5]。 根據(jù)不同年齡段人腸道內(nèi)存在的菌種不同可將雙歧桿菌分為： 嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、 青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、長雙歧桿菌（B. longum）等[6]。雙歧桿菌作為一種益生菌，被認(rèn)為主要通過提供營養(yǎng)和非營養(yǎng)的化合物來促進(jìn)宿主新陳代謝進(jìn)而維護(hù)宿主的健康[7]。 同時雙歧桿菌的其他積極作用表現(xiàn)在緩解腸道疾病方面，例如腸易激綜合征（IBS）和炎癥性腸?。↖BD）等[8-9]。 雙歧桿菌EPS 是雙歧桿菌在生長代謝過程中分泌的一類長鏈聚合物，根據(jù)其相對于菌體的位置分為莢膜多糖和黏液多糖。 因EPS 具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，因此，能夠產(chǎn)生EPS 的雙歧桿菌在相關(guān)益生菌研究中具有重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是一種存在于大多數(shù)細(xì)菌中的碳水化合聚合物，它們可以松散附著在細(xì)菌細(xì)胞表面或釋放到周圍的細(xì)胞環(huán)境，既作為細(xì)菌保護(hù)性表層，也與周圍環(huán)境發(fā)生相互作用[10]。多年來，對細(xì)菌胞外多糖研究的熱度一直有增無減，不僅僅因為它們對生物膜形成的貢獻(xiàn)，更重要的是因為EPS 是幾種傳染病的潛在的毒力因子[11]。 近幾年由于發(fā)現(xiàn)EPS 能夠調(diào)節(jié)與周圍環(huán)境的交流以及它們對宿主健康維護(hù)的貢獻(xiàn)及其在食品、化妝品和醫(yī)藥方面的潛在應(yīng)用使得對EPS 的研究受到更大的關(guān)注[11]。

EPS 合成分為糖核苷酸合成和eps 基因簇合成2 個階段。糖類經(jīng)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成糖核苷酸。 糖核苷酸作為合成EPS 的前體物質(zhì)， 在pgmA、galE、galU等管家基因和eps基因簇的調(diào)控下完成EPS 的合成、聚合以及向細(xì)胞外輸出等[12]。 在乳酸菌菌株中指導(dǎo)EPS合成的基因首次在Streptococcus thermophilusSfi6被報道，該簇長為14.5 kb，由13 個基因組成[13]。 據(jù)報道， 乳酸菌EPS 生物合成過程中各前體物質(zhì)和酶，均已被證明能夠影響EPS 的產(chǎn)量[14]。 其中Lactococcus lactisstrain NIZO B40 菌株含有一個42.2 kb EPS 質(zhì)粒，存在一個12 kbeps操縱子。將整個NIZO B40eps基因簇克隆到高拷貝數(shù)載體pIL253 中， 導(dǎo)致EPS 生產(chǎn)水平幾乎增加了4 倍[15]。然而，eps基因簇并不是影響EPS 生物合成的唯一決定性因素。 Welman 等人研究表明6-磷酸葡萄糖似乎是連接EPS 合成代謝途徑和糖酵解分解代謝途徑的中間關(guān)鍵體[16]。 這些結(jié)果表明EPS 生物合成機(jī)制在不同的菌株中是不同的、復(fù)雜的。

目前，相較于乳酸菌的其他種屬，雙歧桿菌EPS合成相關(guān)基因及其生物工程改造方面的研究報道較少。 因此，作者闡明EPS 前體糖核苷酸合成途徑并尋找與EPS 合成相關(guān)的基因簇， 在此基礎(chǔ)上將EPS 合成相關(guān)的基因進(jìn)行異源表達(dá)， 為進(jìn)一步探索EPS 合成途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長雙歧桿菌A17：分離自健康嬰兒糞便，保存于內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；pET-28a 質(zhì)粒：北納生物頌司產(chǎn)品； 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α：Trans Gen Biotech 產(chǎn)品；MRS 培養(yǎng)基： 北京陸橋公司產(chǎn)品；溶菌酶：天根生化公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒： 天根生化公司產(chǎn)品；Quick DNA Purification Kit DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒小提試劑盒、Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒：CWBIO公司產(chǎn)品；T4 DNA Ligase：TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

超凈工作臺：南京MDS 公司產(chǎn)品；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；YU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司產(chǎn)品； 瓊脂糖凝膠電泳儀：BIO-RAD 公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀：德國Jena 分析儀器公司產(chǎn)品；核酸濃度檢測儀：Themro 公司產(chǎn)品。

1.3 研究方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析使用基于IlluminaMiSeq測序平臺的二代測序技術(shù)和基于PacBio 測序平臺的三代測序技術(shù)對文庫進(jìn)行測序后， 采用NCBI 公認(rèn)的原核生物編碼基因預(yù)測軟件GeneMarkS 對所有基因進(jìn)行預(yù)測。 最后使用eggNOG-mapper、KAAS自動化注釋系統(tǒng)、InterPro、BLASTP 等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1） PCR 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中長雙歧桿菌pgm基因完整序列，設(shè)計引物并交由華大科技公司合成（見表1）。 PCR（25 μL 體系）反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)，72 ℃終延伸6 min。PCR 擴(kuò)增后電泳檢測，并進(jìn)行膠回收、純化。

表1 PCR 擴(kuò)增所用引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used for PCR amplification

2） pET28a-pgm重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒從大腸桿菌中提取pET-28a 質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒和克隆后測序正確的pgm基因分別用BamHⅠ和Hind III 酶雙酶切， 酶切后的混合物用Quick DNA Purification Kit DNA 產(chǎn)物純化試劑盒純化，16℃連接14 h。 連接體系（10 μL ）：1 μL 10×T4 連接緩沖液，1 μL T4 DNA 連接酶，1 μL 雙酶切后的pET28a 載體，3 μL 雙酶切后的pgm基因，4 μL ddH2O。

3） 重組質(zhì)粒pET28a-pgm的轉(zhuǎn)化與鑒定 取50 μL DH5α 與重組質(zhì)粒混合，冰上放置30 min，42℃水浴熱擊90 s，迅速置于冰上冷卻5 min，加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基（不含Kan）中，37 ℃培養(yǎng)1 h 完成轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化完成的菌液涂布于LB 固體平板上（含Kan），37 ℃培養(yǎng)18 h 篩選陽性重組子。 隨機(jī)挑取4個陽性重組子單菌落進(jìn)行菌落PCR。 將挑取的單菌落懸浮于20 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的TritonX-100 細(xì)胞裂解液中，置于沸水浴3 min，使細(xì)胞裂解，以裂解液為模板，進(jìn)行PCR 并電泳檢測。 挑取電泳條帶正確的菌落PCR 的副板單菌落于5 mL LB 液體培養(yǎng)基 （Kan 50 μg/mL） 中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。 用Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒， 送測序。 同時對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和電泳檢測，鑒定pET28a-pgm重組表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。 重組成功的大腸桿菌在甘油管中保種，-80 ℃冰箱保存。

4） 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 抗性平板上挑取單菌落，加入20 mL 含卡那抗性的LB 液體培養(yǎng)基，過夜搖菌， 以體積分?jǐn)?shù)1%的接種轉(zhuǎn)接于50 mL 含卡那抗性的LB 液體培養(yǎng)基， 待菌液的OD 值為0.6時， 加入0.4 mmol/L 的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h，使蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。 用5 mL NTA-0 平衡緩沖液懸浮破碎菌液；10 000g，20 min 離心； 用5 mL NTA-0 重懸沉淀； 將上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳。

5） 目的蛋白的分離與純化 將上清液進(jìn)行His-tag 親和層析（Invitrogen?），層析產(chǎn)物濃縮后進(jìn)行凝膠電泳，檢測目的重組蛋白質(zhì)。 層析產(chǎn)物進(jìn)一步用AKTA Purifier 分子篩去除其他的雜蛋白質(zhì)，收集特定峰所對應(yīng)的樣品，SDS-PAGE 凝膠電泳檢測驗證是否獲得了高純度目的重組蛋白質(zhì)。 以牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford 法測定目的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS 基因簇預(yù)測結(jié)果

以已報道的雙歧桿菌EPS 基因簇為基礎(chǔ)，利用不同雙歧桿菌此類簇邊界處的保守區(qū)域進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌A17 存在一個由19 個基因（chr-354 到chr-413）組成的，長度約為20 kb 的簇，命名為A17eps基因簇。 EPS 基因簇結(jié)果如圖1 所示。

圖1 A17 eps 基因簇與其他EPS 基因簇的比較分析結(jié)果Fig. 1 Comparative analysis results of A17 eps gene cluster and other EPS gene clusters

2.2 EPS 前體糖核苷酸生物合成途徑分析

據(jù)圖2 分析得知，乳糖可被lacZ和LCT編碼的乳糖酶水解為D-半乳糖和α-D-葡萄糖，再經(jīng)半乳糖激酶（galK）、葡萄糖磷酸變位酶（pgm）以及UDP-糖焦磷酸化酶 （USP） 等的作用下分別轉(zhuǎn)化形成UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖。 其中，UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖之間可經(jīng)UDP 葡萄糖-4-表異構(gòu)酶（galE）相互進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 經(jīng)乳糖代謝產(chǎn)生的UDP 葡萄糖可與新的1-磷酸半乳糖反應(yīng)生成1-磷酸葡萄糖，也可進(jìn)入糖原合成通路參與糖原的合成。 葡萄糖經(jīng)葡糖激酶（glk）轉(zhuǎn)化為葡萄糖六磷酸，磷酸葡萄糖變位酶（pgm）使葡萄糖6-磷酸進(jìn)一步形成葡萄糖1-磷酸， 產(chǎn)物再經(jīng)UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（galU） 、UDP-糖焦磷酸化酶（USP）轉(zhuǎn)變最后形成UDP-葡萄糖。因此，長雙歧桿菌A17 菌株利用葡萄糖， 乳糖， 通過以上方式形成2 種糖核苷酸（UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖）。為后續(xù)合成EPS A17提供原材料，EPS A17 的結(jié)構(gòu)已另文發(fā)表[20]。

2.3 pET28a-pgm 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

pgm基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3 所示。 菌落PCR 的擴(kuò)增結(jié)果如圖4 所示。

E1：β-半乳糖苷酶；E2：醛糖1-差向異構(gòu)酶；E3：半乳糖激酶；E4：UDP-糖焦磷酸化酶；E5： 乳糖酶-根皮苷水解酶；E6：葡萄糖激酶；E7： 葡萄糖磷酸變位酶；E8：UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；E9：UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；E10：UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶。

圖3 pgm 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of the PCR amplification product of gene pgm

圖4 菌落PCR 的擴(kuò)增電泳圖Fig. 4 Electrophoresis of colony PCR amplification

電泳結(jié)果顯示，基因片段大小接近1 700 bp 左右與目標(biāo)片段（1 677 bp）長度吻合。 菌落PCR 結(jié)果表明該載體成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。 pET28a-pgm重組表達(dá)載體構(gòu)建及雙酶切電泳結(jié)果如圖5 所示。

圖5 pET28a-pgm 重組表達(dá)載體構(gòu)建及相關(guān)產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig. 5 Electrophoresis results of the pET28a-pgm recombinant expression vector constr uction and related products

在圖5 中，1 號泳道為空pET-28a 質(zhì)粒載體，長度為5 369 bp，但是電泳圖中的克隆片段為4 000~7 000 bp， 這是由于在4 000~7 000 bp 區(qū)域中質(zhì)粒超螺旋形式的比例最大， 與線狀DNA 和開環(huán)DNA相比，超螺旋DNA 電泳速度最快，因此4 000~5 000 bp 出現(xiàn)最亮的條帶。 2 號泳道為空載體雙酶切產(chǎn)物，酶切后電泳速度要比原載體慢，故在5 000~6 000 bp 出現(xiàn)最亮的條帶。 3、4 號泳道的擴(kuò)增片段長度大約7 000 bp 左右，與pET28a-pgm重組表達(dá)載體序列長度的6 974 bp 吻合。 5、6 號泳道為pET28a-pgm重組表達(dá)載體的雙酶切產(chǎn)物， 電泳圖中pgm基因濃度太低， 條帶不明顯。 7、8 號泳道為pET28a-pgm重組表達(dá)載體的PCR 產(chǎn)物， 擴(kuò)增片段大小在1 700 bp 左右，符合pgm基因長度。 9、10 號泳道作為陽性對照（A17 中pgm基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物）。

將pET28a-pgm重組表達(dá)載體的測序結(jié)果BLASTx 比對分析， 結(jié)果顯示重組表達(dá)載體中的pgm基因序列與網(wǎng)站中序列完全匹配， 證明重組表達(dá)載體中的pgm基因就是EPS 合成過程中編碼葡萄糖磷酸變位酶的關(guān)鍵基因。

2.4 目的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化

活化重組成功的大腸桿菌， 用IPTG 誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白質(zhì)。 誘導(dǎo)后離心菌液，對上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果如圖6 所示。 誘導(dǎo)產(chǎn)物用His-tag 親和層析純化，結(jié)果如圖7 所示。目的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為60 000 左右，從電泳圖中可以看出，1 泳道的未經(jīng)誘導(dǎo)對照組在60 000 左右沒有蛋白質(zhì)，IPTG 誘導(dǎo)的上清液和沉淀中60 000 處有條帶，說明重組大腸桿菌成功表達(dá)了目的蛋白質(zhì)，并且上清液中的目的蛋白質(zhì)含量明顯多于沉淀，說明蛋白質(zhì)主要在上清液里。

圖6 IPTG 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果Fig. 6 Results of IPTG-induced protein expression

圖7 親和層析純化結(jié)果Fig. 7 Affinity chromatography results

對含目的蛋白質(zhì)的上清液進(jìn)行His-tag 親和層析，純化蛋白質(zhì)，層析產(chǎn)物濃縮電泳，1 號泳道中出現(xiàn)目的條帶，2 號泳道是層析中出現(xiàn)的雜蛋白質(zhì)。利用AKTPurifier 分子篩去除雜蛋白質(zhì)，可得到高純度（95%）的目的蛋白質(zhì)。

2.5 目的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

采用最為常見的Bradford 法進(jìn)行測定，每個樣品均3 次重復(fù)。 將BSA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，該法所測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線在質(zhì)量濃度2.5~15 μg/mL 范圍內(nèi)保持線性關(guān)系。 測定目的蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.025 1x+0.019 3，濃縮后蛋白質(zhì)測定的OD 值為：y=0.302（平均值），因此求得x約為11.3 μg/mL。 由于蛋白質(zhì)是經(jīng)過稀釋100 倍后測定的，故計算得重組蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度為1.130 mg/mL， 目的蛋白質(zhì)表達(dá)量較高，可實現(xiàn)量產(chǎn)。

3 結(jié) 語

因為雙歧桿菌在腸道中可以抑制有害細(xì)菌，改善胃腸道屏障功能[21]，長期以來一直被用作益生菌來改變腸道菌群組成以緩解各種疾病。 最近的研究表明，雙歧桿菌可改變樹突狀細(xì)胞的功能，以調(diào)節(jié)腸道對無害抗原和細(xì)菌的免疫穩(wěn)態(tài)，或啟動針對病原體的機(jī)體保護(hù)措施[22-25]。 據(jù)報道，很多雙歧桿菌會合成EPS，由于EPS 具有與周圍環(huán)境溝通的能力以及對宿主健康的維護(hù)，受到了科學(xué)界相當(dāng)大的關(guān)注[26]。一些體外研究表明，特定的EPS 可以在產(chǎn)EPS 的菌中發(fā)揮有益的作用[22]。 然而，值得注意的是，由于雙歧桿菌EPS 的產(chǎn)率低，這些聚合物作為市售益生元添加劑的用途非常有限[26]。 可通過優(yōu)化發(fā)酵條件例如優(yōu)化發(fā)酵時間、pH、培養(yǎng)溫度、碳氮源等或者通過基因工程技術(shù)等來提高胞外多糖產(chǎn)量。 在進(jìn)行基因工程改造菌株時可通過超量表達(dá)EPS 合成途徑中的基因例如磷酸葡萄糖變位酶（pgm）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（galU）等來提高EPS 產(chǎn)量，以期解決雙歧桿菌作為一種益生菌但其胞外多糖產(chǎn)量低下的問題[26-28]。

EPS 的合成是一個很復(fù)雜的過程， 包括糖進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、前體糖核苷酸的形成以及胞外多糖合成與輸出[20]。乳酸菌的EPS 生物合成由eps基因簇調(diào)控，決定EPS 重復(fù)單元的合成、聚合、輸出等過程。在本研究中經(jīng)過一系列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，EPS 的生物合成與一個關(guān)鍵的基因相關(guān)，在乳酸菌當(dāng)中通過過表達(dá)該基因使胞外多糖的產(chǎn)量有較大幅度的提升。雙歧桿菌eps基因簇沒有像LAB“保守”eps基因簇一樣的特性，且種間和種內(nèi)的差異極大[11]，本研究中在與其它雙歧桿菌eps基因簇進(jìn)行比較時也發(fā)現(xiàn)這一點，說明單一研究某一種雙歧桿菌來推斷其它雙歧桿菌的eps基因簇是不可取的， 只能與其它雙歧桿菌進(jìn)行比較分析。 結(jié)合作者所在實驗室前期長雙歧桿菌A17 全基因組測序結(jié)果，成功分析到胞外多糖A17 的合成途徑。

在乳酸菌及其亞種當(dāng)中，提高胞外多糖產(chǎn)量的途徑可通過優(yōu)化發(fā)酵條件， 例如改變培養(yǎng)溫度、優(yōu)化發(fā)酵時間、碳源等來實現(xiàn)。 為了提高雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量低的問題， 通過選取pET28a 重組表達(dá)質(zhì)粒實現(xiàn)了葡萄糖磷酸變位酶的大量表達(dá)，為從分子手段調(diào)控雙歧桿菌EPS 的產(chǎn)量提供了新的途徑。將以往解決胞外多糖產(chǎn)量問題從傳統(tǒng)的優(yōu)化培養(yǎng)條件上升到選取拷貝數(shù)與表達(dá)效果兼優(yōu)的質(zhì)粒，大大縮短了實驗時間，更快更高效解決胞外多糖產(chǎn)量低下的問題，對后續(xù)開展針對雙歧桿菌及其EPS 功能研究以及進(jìn)一步闡明雙歧桿菌EPS 生物合成具有重要意義。