高凈樂， 顧璐萍， 常翠華， 李俊華， 楊嚴(yán)俊， 蘇宇杰*

（1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

蛋黃中含有多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)， 氨基酸配比均衡，消化率高達(dá)98%，生物學(xué)價(jià)值高達(dá)96，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他動(dòng)植物性食物蛋白質(zhì)的消化率和生物學(xué)價(jià)值[1]。此外，蛋黃中還含有免疫球蛋白（immunoglobulin of egg yolk，IgY）、卵磷脂、卵黃高磷蛋白等活性成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中，IgY 因具有良好抑菌活性以及廉價(jià)易得、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望部分代替抗生素用于細(xì)菌感染性疾病的治療及提高免疫力[2]。 與傳統(tǒng)IgY 提取方法相比，凍融-水稀釋法[3]能有效簡(jiǎn)化提取流程、提高產(chǎn)品純度，因而成為一種極具應(yīng)用前景的IgY 提取新方法。 然而，在凍融-水稀釋法提取IgY 過程中將會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物—凍融蛋黃顆粒 （freeze-thaw egg yolk pellet，F(xiàn)YP）。FYP 因經(jīng)過凍融和高速剪切處理而發(fā)生嚴(yán)重變性，幾乎喪失其原有的溶解性、乳化性等功能特性，無(wú)法直接用于食品加工，大大降低了蛋品的附加值。 此外FYP 中還含有豐富的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 若不加以利用而直接丟棄，勢(shì)必造成蛋黃資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。 因此，如何充分利用FYP 成為IgY 提取與蛋黃資源綜合利用中一個(gè)亟待解決的課題。

近年來(lái)，限制性酶解技術(shù)因能顯著改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)原料，如大豆蛋白[4]、乳清蛋白[5]、蛋黃粉[6]等。 Gu 等發(fā)現(xiàn)限制性酶解可使大分子蛋白質(zhì)分解為小分子的肽或氨基酸，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性[7]；Bao 等認(rèn)為溶解性與蛋白質(zhì)的其他功能性質(zhì)密切相關(guān)，如乳化性等，并對(duì)堿性、 中性及風(fēng)味蛋白酶的水解效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明堿性蛋白酶能更顯著提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[8]。 因而采用限制性酶解將有望改善FYP 的溶解性及其他功能特性，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

此外，針對(duì)FYP 不易保存的問題，可將經(jīng)酶解后的FYP 進(jìn)行噴霧干燥處理，得到酶解蛋黃顆粒干粉（hydrolyzed egg yolk pellet powder，HYP）。HYP 水分含量低，在運(yùn)輸與保質(zhì)期方面有顯著優(yōu)勢(shì)。 然而，其脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%~60%， 膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/g，這顯然與目前大眾追求的健康低脂消費(fèi)觀相違背。 因此，選擇合適的方法對(duì)HYP 中的油脂進(jìn)行分離，一方面可降低蛋黃顆粒中的脂質(zhì)及膽固醇含量， 有利于提高酶解蛋黃顆粒的消費(fèi)者接受度、拓寬其應(yīng)用范圍，與此同時(shí)又可以制得副產(chǎn)品蛋黃油，進(jìn)一步提高蛋黃綜合利用率。 目前，蛋黃粉中蛋黃油分離的方法主要包括有機(jī)溶劑法、酶法[9]、超臨界萃取法、亞臨界萃取法等。 其中，超臨界和亞臨界萃取技術(shù)是2 種新型綠色油脂萃取技術(shù)，具有無(wú)溶劑殘留，提取率高，保護(hù)有益成分等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。 且與超臨界萃取技術(shù)相比，亞臨界萃取成本更低，常溫萃取、低溫脫溶，易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用[12]。 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于采用亞臨界萃取技術(shù)提取蛋黃粉中脂質(zhì)的研究較少。

作者以凍融-水稀釋法提取蛋黃免疫球蛋白之后變性嚴(yán)重的凍融蛋黃顆粒副產(chǎn)物為原料，采用限制性酶解結(jié)合亞臨界萃取技術(shù)，制得低脂蛋黃粉與副產(chǎn)物蛋黃油，對(duì)亞臨界萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)進(jìn)行研究，以期拓寬凍融蛋黃顆粒副產(chǎn)物的應(yīng)用范圍，進(jìn)而為蛋黃資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋和葵花籽油： 購(gòu)自江蘇無(wú)錫超市；堿性蛋白酶：購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司；鄰苯二甲醛（OPA）、1-4-二硫蘇糖醇（DTT）：購(gòu)自Sigma公司；其余化學(xué)試劑：均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（AB204-N）：梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；噴霧干燥機(jī)（MOBILE MINOR）：基伊埃工程技術(shù)（中國(guó)）有限公司；冷凍離心機(jī)（5430R）：德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（DGG-9240A）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀（K9840）：濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)（UH5300）： 日本日立公司產(chǎn)品； 高速剪切器（T25 basic）： 德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品； 激光粒度分析儀（S3500）：美國(guó)Microtrac 公司產(chǎn)品；冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8100）：日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司產(chǎn)品；CBE-5L 亞臨界流體萃取實(shí)驗(yàn)成套設(shè)備：河南省亞臨界萃取設(shè)備工程技術(shù)研究中心產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 凍融蛋黃顆粒（FYP）的制備參考王旭婷等[3]人提取IgY 的方法并作適當(dāng)修改，人工分離蛋黃和蛋清，并將蛋黃在吸水紙上小心滾動(dòng)以去除表面殘留蛋清。 用鑷子刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，將其放置在（-18±2） ℃的溫度下冷凍8 h，之后在4 ℃的溫度下解凍，得到蛋黃凝膠。 將蛋黃凝膠與去離子水以質(zhì)量比1∶5 混合， 然后用高速剪切機(jī)以11 000 r/min 剪切15 s， 再將混合液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min， 得到上清液為IgY 粗提液，沉淀即為FYP。

1.3.2 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）的制備及成分分析將FYP 與去離子水以質(zhì)量比1∶2 混合，25 ℃攪拌30 min，使其混合均勻。 預(yù)熱至50 ℃，并用1 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)體系pH 至8.0。 加酶量分別為250、500、1 000、2 000 U/g， 反應(yīng)4 h， 酶解過程中用1 mol/L 的NaOH 維持體系pH 值恒定，用磁力攪拌器攪拌使FYP 始終保持分散均勻。 酶解過程中每隔0.5 h 取0.4 mL 的水解液， 迅速用冰水浴冷卻至室溫，測(cè)定水解度（DH）。 同樣條件處理的未加酶組為對(duì)照組。 反應(yīng)結(jié)束后，迅速將水解液用冰水浴冷卻至室溫，經(jīng)噴霧干燥得到酶解蛋黃粉（HYP），噴霧干燥入口溫度175~185 ℃，出口溫度80~90 ℃，適當(dāng)調(diào)整不同水解度水解液的干燥時(shí)的進(jìn)出口溫度，確保所得干燥產(chǎn)品的流動(dòng)性基本接近，HYP 在4 ℃下貯存。 對(duì)制得的HYP 成分進(jìn)行測(cè)定，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照GB/T 5009.3—2016 中的第一法直接干燥法測(cè)定； 蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016 中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定；脂肪含量采用氯仿－甲醇改良法[13]測(cè)定；磷脂含量參照GB/T 5537—2008 中的鉬藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定，并做適當(dāng)修改：為排除其他含磷物質(zhì)的干擾，先提取總脂質(zhì)，再測(cè)定磷脂含量；膽固醇含量按照Sun 等[14]人的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 水解度（DH）的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法對(duì)酶解過程中蛋白質(zhì)的水解度（DH）進(jìn)行測(cè)定。首先配置鄰苯二甲醛（OPA）試劑，然后選用L-絲氨酸與OPA 試劑反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將酶解物用去離子水稀釋至4 mg/mL，將400 μL 稀釋液與3 mL OPA 試劑混合， 反應(yīng)2 min 后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定340 nm 處的吸光度。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)水解度DH：

式中：DH 為水解度，%；h為每單位質(zhì)量斷裂的肽鍵質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g；htot為每單位質(zhì)量的肽鍵質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g[17]。

1.3.4 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）激光共聚焦分析參照Xu 的方法[18]用激光共聚焦顯微鏡觀察HYP 的微觀結(jié)構(gòu)， 并做適當(dāng)修改。 將對(duì)照組 （未酶解）與HYP 樣品溶解在去離子水中（質(zhì)量比1∶20），室溫下混勻5 min。 分別將尼羅紅和尼羅藍(lán)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%丙酮中。 脂肪用尼羅紅染色，蛋白質(zhì)用尼羅藍(lán)染色。 取10 μL 尼羅紅和尼羅藍(lán)溶液加入1 mL 樣品溶液中，染色20 min，取20 μL 樣品涂布于顯微鏡載玻片上。 蛋白質(zhì)的分析模式：綠色熒光通道發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為500~595 nm。 油脂的分析模式：紅色熒光通道發(fā)射波長(zhǎng)為633 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為649~780 nm。 對(duì)焦后掃描并保存圖像。

1.3.5 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）溶解度分析溶解度的測(cè)定根據(jù)Tang 等[19]的方法并做適當(dāng)修改，將1 g 樣品和30 mL 去離子水轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，振蕩5 min，然后于8 000 r/min 離心20 min，收集沉淀物，再加入30 mL 去離子水，同樣條件再次離心。最后將所有收集到的沉淀物于鼓風(fēng)干燥箱中在105 ℃的溫度下干燥8 h。 以公式（2）計(jì)算蛋黃粉溶解度S。

式中：S為溶解度，g；m為樣品質(zhì)量，g；m1為沉淀及培養(yǎng)皿總質(zhì)量，g；m2為培養(yǎng)皿質(zhì)量，g。

1.3.6 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）乳化性分析采用比濁法測(cè)定樣品的乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）[20]。 將HYP 樣品分散在去離子水中（2 g/dL），室溫下磁力攪拌1 h。 取30 mL 樣品溶液，加入10 mL 葵花籽油，使用高速乳化器以11 000 r/min乳化1 min。 乳化后于0 min 和10 min 時(shí)分別從管底吸取100 μL 乳液移至10 mL 的0.1 g/dL 十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液中，然后在500 nm 下測(cè)定稀釋溶液的濁度。 ESI 值通過下式計(jì)算：

式中：ESI 為乳化后立即測(cè)定的吸光度；A0和A10分別為乳液在0、10 min 時(shí)的吸光度。

1.3.7 低脂蛋黃粉制備工藝優(yōu)化

1） 亞臨界萃取溶劑選擇 分別選擇丙烷或丁烷作為亞臨界萃取溶劑，制備蛋黃油與低脂酶解蛋黃粉， 以萃取后低脂酶解蛋黃粉中殘油率為指標(biāo)，選擇最佳萃取溶劑。 具體制備工藝如下：

亞臨界丙烷萃?。悍Q取適量HYP 樣品，用150目尼龍紗布袋分裝，置于萃取罐，通過設(shè)備流量閥送入一定體積丙烷，萃取壓力1.1 MPa，萃取溫度35℃，每次萃取40 min，重復(fù)萃取3 次。 然后減壓脫溶，從分離罐底部收集萃取得到的蛋黃油，離心后取上清液置于4 ℃冰箱待分析。 從萃取罐內(nèi)收集剩余低脂酶解蛋黃粉用于進(jìn)一步分析。

亞臨界丁烷萃?。悍Q取適量HYP 樣品，用150目尼龍紗布袋分裝，置于萃取罐（與丙烷相同），通過設(shè)備流量閥送入一定體積丁烷， 萃取壓力0.46 MPa，萃取溫度45 ℃，每次萃取40 min，重復(fù)萃取3次。 后續(xù)操作與上述丙烷相同。

2） 亞臨界萃取工藝優(yōu)化 最終選用丙烷作為萃取溶劑，以萃取后低脂酶解蛋黃粉中殘油率為指標(biāo)，對(duì)萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、料液質(zhì)量體積比等可調(diào)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

萃取溫度： 分別將萃取溫度設(shè)定為25、30、35、40、45 ℃，萃取壓力1.5 MPa，萃取時(shí)間120 min，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進(jìn)行萃取。

萃取壓力：分別將萃取壓力設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 MPa，萃取溫度35 ℃，萃取時(shí)間120 min，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進(jìn)行萃取。

萃取時(shí)間： 分別將萃取時(shí)間設(shè)定為30、60、90、120、150 min，萃取溫度35 ℃，萃取壓力1.5 MPa，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進(jìn)行萃取。

料液質(zhì)量體積比：分別將料液質(zhì)量體積比設(shè)定為l g∶3 mL、l g∶5 mL、l g∶7 mL、l g∶9 mL、l g∶11 mL，萃取溫度35 ℃， 萃取壓力1.5 MPa， 萃取時(shí)間120 min，加入亞臨界丙烷溶劑進(jìn)行萃取。

1.3.8 低脂蛋黃粉理化與功能性質(zhì)分析

1） 殘油率測(cè)定 參照氯仿－甲醇改良法[13]并做適當(dāng)修改。 稱取1 g 左右的待測(cè)蛋黃粉， 加入1.2 mL 去離子水、5 mL 甲醇、2.5 mL 氯仿， 旋渦振蕩2 min，再加入2.5 mL 去離子水和2.5 mL 氯仿，振蕩3 min，使溶液從一相系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成二相系統(tǒng)。 離心分離出氯仿層，用氮?dú)獯等ヂ确?，稱質(zhì)量。

2） 粒度分析 將0.1 g 待測(cè)蛋黃粉溶于10 mL去離子水，旋渦振蕩5 min，保證蛋黃粉溶液混合均勻[7]。 采用激光粒度分析儀測(cè)量不同水解度樣品的粒徑分布。

3） 微觀結(jié)構(gòu)分析 用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察蛋黃粉的微觀結(jié)構(gòu)[21]。 取少量樣品用雙面膠固定，鍍金并進(jìn)行觀察。 每個(gè)樣品選取放大倍數(shù)1 000和2 000 觀察并拍攝。

4） 溶解度分析 方法同1.3.5。

5） 乳化性分析 方法同1.3.6。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差。 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件的Duncan法檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 2018C 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）成分分析

對(duì)HYP 進(jìn)行成分分析，結(jié)果如表1 所示。 與對(duì)照組（未酶解）相比，酶解處理步驟并未顯著改變蛋黃粉主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。 經(jīng)過提取IgY 后剩余的HYP 仍然具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，需要對(duì)其進(jìn)行合理處理以實(shí)現(xiàn)蛋黃資源的充分開發(fā)利用。

表1 HYP 成分分析Table 1 Composition analysis of HYP

2.2 加酶量對(duì)酶解液水解度的影響

如圖1 可知，不同酶添加量的條件下，蛋黃顆粒水解度呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，蛋黃顆粒的快速酶解發(fā)生在反應(yīng)最初的0.5 h 左右， 之后水解度上升趨勢(shì)明顯減緩，經(jīng)4 h 左右，酶解反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)，該變化趨勢(shì)與Gu 等[7]人的研究結(jié)果一致。 此外， 當(dāng)加酶量分別為250、500、1 000 和2 000 U/g時(shí)，隨著加酶量的增加，最終的DH 值逐漸升高，最終DH 分別為8.0%、11.22%、13.85%和13.99%。 這是由于體系中酶分子越多，與底物分子的接觸概率越大，蛋白質(zhì)被酶解產(chǎn)生氨基酸和小肽的量增加從而導(dǎo)致水解度提高。 當(dāng)加酶量超過1 000 U/g 時(shí)，體系的最終水解度值基本無(wú)差異，這可能是由于在此加酶量條件下， 酶對(duì)底物的作用位點(diǎn)已趨于飽和，進(jìn)一步增大加酶量對(duì)水解度的提高作用有限。 為了區(qū)分各組樣品，后續(xù)以加酶量來(lái)表示不同樣品。

圖1 不同加酶量下的酶解液水解度變化Fig. 1 Degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysate under different enzyme dosages

值得注意的是，與未經(jīng)凍融處理的新鮮蛋黃的酶解研究結(jié)果相比，本研究在相同的加酶量和反應(yīng)時(shí)間下可以獲得相對(duì)較高的DH[7]。 這可能是由于IgY 提取過程中的凍融及剪切操作， 導(dǎo)致蛋黃脂蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，從而使堿性蛋白酶可以更好地與底物接觸，促進(jìn)酶水解。

2.3 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）微觀結(jié)構(gòu)分析

為了獲得樣品的微觀結(jié)構(gòu)信息，采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在HYP 中的分布情況。 如圖2 所示，能夠從對(duì)照組樣品清楚地觀察到HYP 是由內(nèi)部的油滴和外部的蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的顆粒組成的，對(duì)照組樣品與原蛋黃粉相比具有更小的粒徑[7]，顆粒表面可以清晰觀察到許多孔洞，這可能與之前的凍融和剪切處理有關(guān)。 經(jīng)酶解處理后，顆粒尺寸變得更小、更為均一，這些結(jié)構(gòu)上的變化可能導(dǎo)致隨著水解度的增加，樣品的溶解度逐漸增加。 值得注意的是，當(dāng)水解程度較低時(shí)，沒有出現(xiàn)游離的脂肪滴，然而，當(dāng)加酶量達(dá)到500~1 000 U/g時(shí)，可以觀察到許多游離的紅色脂肪滴，這可能是由于當(dāng)處于較低的水解度時(shí)，顆粒的結(jié)構(gòu)尚未被破壞，仍然保持其包裹脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，隨著加酶量的增加，蛋黃顆粒表面的蛋白質(zhì)被水解，從而導(dǎo)致內(nèi)部脂質(zhì)的釋放[7]。 當(dāng)加酶量達(dá)到1 000 U/g 時(shí)，出現(xiàn)相對(duì)較大的游離脂肪滴，這可能是由于此時(shí)蛋黃顆粒結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，更多的脂質(zhì)被釋放并聚集從而形成了較大的脂肪滴。 但當(dāng)加酶量進(jìn)一步增加到2 000 U/g 時(shí)，游離的脂肪滴反而減少，同時(shí)出現(xiàn)一些尺寸較大的顆粒， 可能是因?yàn)殡S著水解度提高HYP 的乳化性逐漸提高， 游離的脂肪滴被重新乳化，蛋黃顆粒非極性表面之間發(fā)生疏水相互作用而聚集在一起[19]。

圖2 HYP 及對(duì)照組的激光共聚焦圖Fig.2 CLSM micrographs of HYP and the control group

2.4 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）溶解度分析

蛋白質(zhì)的溶解性與其他功能性質(zhì)如乳化性、發(fā)泡性等密切相關(guān)，因此被認(rèn)為是其最基本的理化性質(zhì)。 如圖3 所示，HYP 的溶解度與對(duì)照組相比顯著提高。 此外，在相對(duì)較低的加酶量條件下，樣品的溶解度提高趨勢(shì)明顯， 而隨著加酶量的進(jìn)一步增大，溶解度上升速度趨緩， 直到達(dá)到一個(gè)相對(duì)恒定值，這與Gao 等電泳觀察到的結(jié)果一致[22]。 水解程度對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性具有積極的作用，當(dāng)水解程度較高時(shí)，形成的多肽相對(duì)分子質(zhì)量較小，溶解性更佳，這主要?dú)w因于小分子多肽表面具有較多的極性氨基酸殘基，易與周圍溶劑環(huán)境的水分子形成更多的氫鍵[23]。 此外，有報(bào)道稱卵黃高磷蛋白質(zhì)和HDL 在自然條件下通過鈣磷橋形成的不溶性復(fù)合物在水解過程中被破壞也會(huì)促使蛋白質(zhì)溶解度提高[24]。

圖3 HYP 及對(duì)照組的溶解度Fig. 3 Powder solubility of HYP and the control group

2.5 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）乳化性分析

乳化性是蛋黃的一項(xiàng)重要的功能特性，可賦予產(chǎn)品所需要的口感和質(zhì)感。 通過測(cè)定ESI 和EAI 來(lái)觀察酶解處理對(duì)樣品乳化性的影響。 如圖4 所示，樣品的EAI 沒有顯著差異（P<0.05），而乳化液的穩(wěn)定性隨著加酶量的增加而顯著提高，這可能與HYP粒徑的減小和溶解度的增加密切相關(guān)。 據(jù)報(bào)道粒徑越小，越有利于形成更均勻、更穩(wěn)定的乳狀液[25]。此外， 較高的表面疏水性也有助于提高乳化性能，這可能由于酶解產(chǎn)生的多肽可通過與油滴相互作用從而形成更強(qiáng)的界面膜[26]。還有研究認(rèn)為，酶解產(chǎn)生的同時(shí)具有親水和疏水基團(tuán)的小肽段轉(zhuǎn)移到油水界面上，也可能通過降低界面張力而起到穩(wěn)定乳液的作用[24]。

圖4 HYP 及對(duì)照組的乳化性質(zhì)Fig. 4 Emulsifying properties of HYP and the control group

2.6 蛋黃粉殘油率對(duì)比分析

如圖5 所示，原蛋黃粉（OEYP）、亞臨界丙烷萃取后的蛋黃粉（EYP-P）及亞臨界丁烷萃取后蛋黃粉（EYP-B） 的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為58.75%、37.00%、45.25%。 由此可見，與丁烷相比，亞臨界丙烷顯示出了對(duì)蛋黃粉中油脂更強(qiáng)的提取能力。

圖5 亞臨界丙烷和丁烷萃取后蛋黃粉脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Fig. 5 Analysis of the fat content of egg yolk powder after subcritical propane and butane extraction

2.7 亞臨界萃取工藝優(yōu)化

由亞臨界丙烷和丁烷萃取對(duì)低脂蛋黃粉殘油率指標(biāo)的分析可知，亞臨界丙烷對(duì)蛋黃油的萃取效果優(yōu)于丁烷。 此外，前期的研究結(jié)果顯示，與亞臨界丙烷相比，采用亞臨界丁烷萃取時(shí)低脂蛋黃粉中磷脂的保留率更低，降低了產(chǎn)物低脂蛋黃粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 因而作者最終選擇亞臨界丙烷作為萃取溶劑，并進(jìn)一步對(duì)亞臨界丙烷萃取技術(shù)的工藝參數(shù)包括萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、料液比等進(jìn)行優(yōu)化。

2.7.1 萃取溫度由圖6（a）可知，當(dāng)萃取溫度從25℃升高到35 ℃時(shí)，萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢(shì)，在35 ℃時(shí)殘油率達(dá)到最低值，若繼續(xù)提高萃取溫度，蛋黃粉殘油率反而呈上升趨勢(shì)。 這可能是由于溫度適當(dāng)升高可有效增大丙烷溶劑的揮發(fā)性和擴(kuò)散系數(shù)，從而更好溶解蛋黃脂質(zhì)，使得蛋黃油提取率提高；然而當(dāng)溫度過高時(shí)，萃取溶劑在萃取釜中易氣化，萃取過程中傳質(zhì)推動(dòng)力減小，油脂提取率反而降低[27]。 另外，萃取溫度過高會(huì)增加能耗， 并會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)中磷脂等活性物質(zhì)的變性與降解，故萃取溫度宜選擇35 ℃。

圖6 萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間、料液體積質(zhì)量比對(duì)蛋黃粉殘油率的影響Fig. 6 Effect of temperature, pressure, time and solid-liquid ratio on the residual oil rate of egg yolk powder

2.7.2 萃取壓力由圖6（b）可知，當(dāng)萃取壓力從0.5 MPa 升高到1.5 MPa 時(shí)， 萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢(shì)，繼續(xù)增大萃取壓力，殘油率未發(fā)生顯著改變。 原因可能是由于在溫度不變的條件下，當(dāng)萃取壓力達(dá)到一定值時(shí)，丙烷對(duì)甘油三酯和膽固醇的溶解趨于飽和，而進(jìn)一步提高萃取壓力反而使丙烷的傳質(zhì)效率降低，萃取效率隨之降低。 故萃取壓力宜選擇1.5 MPa。

2.7.3 萃取時(shí)間由圖6（c）可知，當(dāng)萃取時(shí)間從30 min 增加到120 min 時(shí)， 萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢(shì)，繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，殘油率下降不顯著。 且隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，能量消耗增大，萃取成本提高。 因此， 考慮實(shí)際需求， 萃取時(shí)間為120 min 最適宜。

2.7.4 料液質(zhì)量體積比由圖6（d）可知，隨著液化丙烷體積的增加， 萃取后蛋黃粉殘油率顯著下降，但是當(dāng)料液質(zhì)量體積比超過1 g∶7mL 時(shí)， 殘油率下降不顯著，且丙烷溶劑的消耗增加也會(huì)提高萃取成本。 因此，綜合考慮殘油率與成本需求，選擇1 g∶7 mL 作為最合適的料液質(zhì)量體積比。

綜上，亞臨界丙烷萃取脫除HYP 中脂質(zhì)的最佳條件為：溫度35 ℃，壓力1.5 MPa，時(shí)間120 min，料液質(zhì)量體積比為1 g∶7 mL。此條件下，不同加酶量的HYP 經(jīng)過亞臨界丙烷萃取后，所得低脂酶解蛋黃粉的殘油率分別為26.00%、23.25%、19.25%、15.50%、20.23%。

2.8 低脂蛋黃粉理化與功能特性分析

2.8.1 粒度分析如圖7 所示， 與對(duì)照組相比，酶解后的蛋黃顆粒樣品整體呈現(xiàn)出更小的粒徑。 隨著加酶量的增加，樣品的粒徑逐漸變小。 表明隨著加酶量的增加， 蛋黃脂蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞愈發(fā)嚴(yán)重，更有助于脂質(zhì)溶出。 這也在一定程度上能夠解釋亞臨界萃取后蛋黃粉中殘油率會(huì)隨加酶量的增加而下降的現(xiàn)象。

圖7 蛋黃粉的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of egg yolk powder

2.8.2 微觀結(jié)構(gòu)分析掃描電鏡（SEM）結(jié)果表明經(jīng)過亞臨界萃取處理后蛋黃粉的微觀結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化，如圖8 所示。 與對(duì)照組（只剪切，未酶解）相比，HYP 經(jīng)亞臨界丙烷萃取后結(jié)構(gòu)被破壞愈發(fā)嚴(yán)重，這更有助于蛋黃油的提取。 隨著酶解程度的增大，HYP 的平均尺寸明顯減小，聚集減少。但當(dāng)加酶量為2 000 U/g 時(shí)， 蛋黃顆粒干粉出現(xiàn)聚集結(jié)塊現(xiàn)象。 這可能是由于堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)生了大量的小分子， 而水解暴露的疏水基團(tuán)與脂蛋白結(jié)合，導(dǎo)致微小顆粒的大量聚集結(jié)塊[28]。 此外當(dāng)加酶量較高時(shí)樣品粒度過細(xì)，樣品在萃取罐中更易受萃取壓力擠壓而結(jié)塊，在一定程度上阻礙了亞臨界溶劑對(duì)樣品的滲透和油脂的提取，從而使得萃取后蛋黃粉的殘油率較高。 這一結(jié)果與低脂蛋黃粉殘油率測(cè)定結(jié)果一致。

圖8 蛋黃粉的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM images of egg yolk powder

2.8.3 溶解特性分析如圖9 所示，由HYP 提油制得的低脂蛋黃粉的溶解度均顯著高于未酶解組。 與脫脂前HYP 的溶解度相比較，經(jīng)亞臨界萃取后低脂蛋黃粉的溶解度大多會(huì)進(jìn)一步提高，但當(dāng)加酶量達(dá)到2 000 U/g 時(shí)，HYP 經(jīng)亞臨界丙烷萃取后所得低脂蛋黃粉的溶解度反而下降。 這可能是由于水解度較高時(shí)產(chǎn)生蛋黃顆粒較小，在亞臨界萃取過程中顆粒易產(chǎn)生顆粒聚集結(jié)塊現(xiàn)象，從而導(dǎo)致蛋黃粉的溶解度變差。 由此可見，經(jīng)酶解和亞臨界萃取步驟得到的低脂蛋黃粉具備良好的溶解性能。

圖9 蛋黃粉的溶解性Fig. 9 Solubility of egg yolk powder

2.8.4 乳化特性分析如圖10（a）所示，與對(duì)照組（未酶解）相比，低脂蛋黃粉的乳化活性無(wú)顯著性差異， 而乳化穩(wěn)定性隨著加酶量的增加顯著提高，當(dāng)加酶量達(dá)到1 000 U/g 時(shí)，乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值，這與HYP 的乳化穩(wěn)定性變化趨勢(shì)基本一致。 蛋黃粉的乳液宏觀結(jié)果（20 min 內(nèi)）如圖10（b）所示，低脂蛋黃粉的乳化性能明顯優(yōu)于對(duì)照組。 由此可見，經(jīng)酶解和亞臨界萃取步驟得到的低脂蛋黃粉具備良好的乳化性能。

圖10 蛋黃粉的乳化性質(zhì)Fig. 10 Emmlsion properties of egg yolk powder

3 結(jié) 語(yǔ)

以凍融-水稀釋法提取蛋黃免疫球蛋白后剩余變性嚴(yán)重的凍融蛋黃顆粒為原料，采用限制性酶解制備酶解蛋黃顆粒干粉（HYP），并進(jìn)一步結(jié)合亞臨界萃取工藝制備低脂蛋黃粉產(chǎn)品。 結(jié)果顯示，酶解處理可以顯著影響HYP 的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，破壞脂蛋白結(jié)構(gòu)，有助于提高亞臨界萃取脫脂效率。 當(dāng)酶添加量為1 000 U/g 時(shí)，在萃取溫度35 ℃，壓力1.5 MPa，時(shí)間120 min，料液質(zhì)量體積比為1 g∶7 mL 的最優(yōu)萃取條件下進(jìn)行亞臨界丙烷萃取，得到低脂蛋黃粉的殘油率僅為15.50%。 作者制備的HYP 和低脂蛋黃粉均呈現(xiàn)良好的溶解和乳化性能，可根據(jù)不同應(yīng)用場(chǎng)合作為食品加工原料加以利用，有效提高蛋黃資源的綜合利用效率。 同時(shí)采用亞臨界萃取技術(shù)還可制得副產(chǎn)物蛋黃油，具備進(jìn)一步開展深入研制新產(chǎn)品的潛力。 因而本研究方法可有效解決凍融-水稀釋法提取免疫球蛋白后剩余蛋黃顆粒功能性差、利用率低的問題，提高蛋黃產(chǎn)品附加值，有望拓寬蛋制品深加工的產(chǎn)業(yè)鏈，推動(dòng)蛋黃資源的綜合利用。