胡 羚， 張惠玲， 周慧寧， 李海峰*

（1. 寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏銀川 750021；2. 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏銀川 750021）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）產(chǎn)業(yè)近年來在國內(nèi)迅速發(fā)展，在青海、寧夏、甘肅等西北地區(qū)形成了產(chǎn)業(yè)化基地[1]。 僅寧夏南部山區(qū)的馬鈴薯加工企業(yè)就有近3 000 家[2]，已成為當?shù)亟?jīng)濟增長的支柱產(chǎn)業(yè)之一。 而在馬鈴薯加工中，會產(chǎn)生大量的汁水，其中約90%來自土豆淀粉、 土豆粉生產(chǎn)等加工工業(yè)[3]，平均每處理6.5 t 馬鈴薯，就會產(chǎn)出1 t 淀粉、5 t 薯渣和20 t 汁水[4]。大量的馬鈴薯淀粉汁水的排放處理已成為馬鈴薯加工中亟待解決的問題。

研究表明，馬鈴薯淀粉加工汁水中主要含有碳水化合物、蛋白質、脂類、有機酸、多酚、礦物質、纖維和生物堿[5]，同時汁水具有“三高”的特點，即高泡沫、高化學需氧量、高生化需氧量[6]。 如果直接排放，汁水中的有機物質非常有利于微生物或致病菌的大量生長繁殖，可能造成環(huán)境中的生物污染問題[7]，且廢水中的蛋白質會在自然發(fā)酵后釋放出硫化氫、氨氣、腐胺、尸胺等惡臭氣味污染環(huán)境[8]。 因此對馬鈴薯淀粉加工汁水進行合理化處理至關重要。

目前馬鈴薯淀粉加工汁水的處理方式有物理法、化學法、生物法[9]。 生物法因相對物理法和化學法具有操作簡便，成本低廉等優(yōu)勢，受到廣泛關注。但馬鈴薯淀粉加工主要集中在當年的9 月至次年3 月[10]，由于秋冬季環(huán)境溫度較低（3~20 ℃），菌株生長緩慢，從而延長了發(fā)酵周期，明顯增加了發(fā)酵過程中的能耗。 相比于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵過程菌種之間存在相互協(xié)同作用，能夠擴大對原料的適應性和防雜菌的能力，因此作者選擇混合菌發(fā)酵馬鈴薯淀粉汁水。

選用能在低溫（15 ℃）發(fā)酵降解馬鈴薯淀粉加工汁水的好氧型苔蘚假單胞菌和厭氧型黏質沙雷氏菌混合使用，通過單因素實驗、響應面實驗提高馬鈴薯淀粉加工汁水中蛋白質的降解率，縮短發(fā)酵周期，降低臭味物質的產(chǎn)生，提高植物生長所需的生長素、氨基酸等，并將發(fā)酵后的汁水進行應用，以促進黃瓜種子發(fā)芽。 在馬鈴薯淀粉廢水綠色化處理的基礎上，將其綜合利用開發(fā)，實現(xiàn)了環(huán)境效益與社會效益雙贏。 尤其對于自然資源匱乏、干旱落后、 水資源極度短缺的寧夏南部山區(qū)而言，本研究為馬鈴薯產(chǎn)品加工后汁水的處理與利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黏質沙雷氏菌（0 號菌）：由作者所在實驗室篩選并保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）；苔蘚假單胞菌（4 號菌）：由作者所在實驗室篩選并保藏。

甲醇、乙腈（色譜純）：Merck 公司產(chǎn)品；腐胺、酪胺、 組胺、 精胺、 亞精胺、 尸胺、 色胺標準品：Olchemim/isoReag 公司產(chǎn)品；BCA 試劑盒：賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；NB 培養(yǎng)基、 酪蛋白培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品； 磷酸鹽試劑盒：上海齊源生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用儀和1100 Series高效液相色譜儀： 美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；NBS-I 型氮吹儀：合肥艾本森科學儀器有限公司產(chǎn)品；FR980 恒溫培養(yǎng)箱： 上海復日科技有限公司產(chǎn)品；全自動氨基酸分析儀：蘇州華美辰公司產(chǎn)品；酶標儀：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機：美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化將保藏在甘油管中的菌株按接種體積分數(shù)2% 分別接種在NB 液體培養(yǎng)基中活化，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，轉接到酪蛋白固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h。

1.3.2 混合菌株拮抗實驗采用劃線法[11]，將活化的菌株在酪蛋白平板上兩兩劃線，一個菌株先平行劃4 條直線，另一個菌株在其垂直方向劃4 條與其相交的線，觀察16 個相交點上是否有抑菌圈，若無則表示2 個菌株間無拮抗作用，反之，則有拮抗作用。

1.3.3 單菌發(fā)酵實驗參考前期單菌發(fā)酵最優(yōu)條件進行單菌發(fā)酵[8]，4 號菌株在15 ℃發(fā)酵48 h、pH為5.35、接種體積分數(shù)為2.37% 的條件下發(fā)酵馬鈴薯汁水， 測其蛋白質降解率；0 號菌株在15 ℃發(fā)酵48 h，pH 為6.18，接種體積分數(shù)為4.99% 的條件下發(fā)酵馬鈴薯汁水，測其蛋白質降解率。

1.3.4 混合菌單因素實驗

1） 接種體積分數(shù)對蛋白質降解率的影響 發(fā)酵溫度為15 ℃， 發(fā)酵時間為48 h，1∶1 的質量比混合，接種體積分數(shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%，測定發(fā)酵后蛋白質質量濃度的變化。

2） 菌種配比對蛋白質降解率的影響 發(fā)酵溫度為15 ℃，發(fā)酵時間為48 h，接種體積分數(shù)為2%，0 號菌與4 號菌質量比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，測定發(fā)酵后蛋白質質量濃度的變化。

1.3.5 混合菌響應面優(yōu)化實驗根據(jù)單因素試驗，選擇菌種復配比、接種體積分數(shù)這2 個因素中自變量的最佳參數(shù)， 進行兩因素三水平的正交試驗，并利用 Design Expert 8.0 軟件， 采用 Central Composite Design 進行響應面優(yōu)化。 實驗設計因素見表1。

表1 實驗設計因素Table 1 Experimental design factors

1.3.6 驗證實驗將響應面優(yōu)化后得到的最適條件進行驗證實驗，在15 ℃發(fā)酵48 h，測定空白（未發(fā)酵）、0 號菌、4 號菌、最優(yōu)混合菌發(fā)酵液中的蛋白質、氨氮、磷酸鹽、胺類物質、揮發(fā)性物質、氨基酸及植物生長激素。

1.3.7 黃瓜種子發(fā)芽實驗每個培養(yǎng)皿中加適當稀釋的自然發(fā)酵汁水、混菌發(fā)酵汁水各10 mL，將預處理好的30 粒黃瓜種子均勻擺入培養(yǎng)皿中， 以去離子水作對照， 每個處理6 次重復，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，發(fā)芽結束后統(tǒng)計發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚軸長度。

1.4 測定方法

1.4.1 蛋白質質量濃度測定取發(fā)酵后的汁水，用BCA 蛋白質試劑盒在酶標儀中測定樣品中的蛋白質質量濃度，蛋白質標準曲線見圖1。Fig. 1 Protein standard curve

圖1 蛋白質標準曲線

1.4.2 氨氮質量濃度測定參考GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》[12]進行測定。

1.4.3 磷酸鹽質量濃度測定磷酸鹽質量濃度的變化采用孔雀綠顯色劑和鉬酸鹽，鉬酸鹽可與無機磷酸鹽特異結合形成一種穩(wěn)定的有色化合物[13]。

1.4.4 氨基酸質量分數(shù)測定采用全自動氨基酸分析儀測定汁水中各必需氨基酸質量分數(shù)。

1.4.5 胺類物質測定采用高效液相色譜法測定，參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準食品中生物胺的測定》進行測定[14]。

1.4.6 揮發(fā)性氣體測定取5 mL 樣品置于頂空瓶中，用帶有50/30 μm DVB/CAR on PDMS 萃取纖維頭的自動進樣器插入瓶內(nèi)，于90 ℃平衡30 min，再壓縮手柄伸出萃取頭萃取30 min，取出，立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）解析3 min[15]。 GC條件為：HP-5 MS 石英毛細管柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm），程序升溫（初始溫度50 ℃，保持1 min；以4 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min），進樣口溫度250 ℃，載氣高純度氦氣，載氣流量1.0 mL/min，不分流進樣。 MS 條件為：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230 ℃，四級桿溫度180 ℃，電子能量70 eV，m/z檢測范圍35～550[16]。

1.4.7 植物生長激素質量濃度測定

1） 樣本前處理 移取50 μL 樣本，用1 mL 甲醇-水-甲酸（體積比15∶4∶1）進行提取濃縮[17]，后用100 μL 體積分數(shù)80% 甲醇溶液復溶， 過0.22 μm濾膜，置于進樣瓶中，等待LC-MS/MS 分析[18]。

2） 液相條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 柱（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流動相：A 相超純水，B 相乙腈，梯度洗脫程序：流動相體積比A/B在0~8.0 min 為95∶5；8.0 min 時變至5∶95，保持1 min；9.1 min 時變?yōu)?5∶5，保持至12.0 min。流量0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL[19-20]。質譜條件主要包括：電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）溫度550 ℃，正離子模式下質譜電壓5 500 V，負離子模式下質譜電壓-450 0 V， 氣簾氣（Curtain Gas）241 kPa。在Q-Trap 6500+中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）對每個離子進行掃描檢測[21-22]，再利用軟件Analyst1.6.1 處理所得數(shù)據(jù)。

3） 標準曲線 配制0.05、0.5、1、5、10、50、100 ng/mL 的標準品溶液，測定各個質量濃度的峰面積，以各質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制不同物質的標準曲線[23]，標準曲線線性方程及相關系數(shù)見表2。

表2 標準曲線線性方程及相關系數(shù)Table 2 Standard Curves

4） 各激素質量濃度的計算 將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算。

式中：Cs為樣本中激素質量濃度，ng/mL；c為樣本中積分峰面積比值代入標準曲線得到的質量濃度，ng/mL；V1為復溶時所用溶液的體積，μL；V2為移取的樣本體積，mL。

2 結果與分析

2.1 拮抗實驗

如圖2 所示， 酪蛋白平板上2 株菌均生長良好，兩兩交叉處無抑菌圈，說明2 株菌之間無拮抗作用，可以用于混合發(fā)酵。

圖2 2 株菌的拮抗實驗Fig. 2 Antagonistic effect test of 2 strains of bacteria

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同接種體積分數(shù)對蛋白質降解率的影響馬鈴薯淀粉汁水中的有機物的降解率往往會隨著微生物濃度的提高而增加。 由圖3 可知，隨著接種質量分數(shù)的增加，蛋白質降解率先升高后又逐漸降低， 接種體積分數(shù)在2% 時蛋白質降解率最高，達26.91%。 當接種體積分數(shù)過小時，菌種濃度過低，在低溫環(huán)境過久菌種活性可能會降低， 生長緩慢，導致蛋白質的利用率低；接種體積分數(shù)過大時，可能導致菌種因營養(yǎng)物質不足相互競爭， 導致菌體死亡，降解率下降；而當接種體積分數(shù)為5%時，蛋白質降解率有一定回升，可能是汁水中有微生物在競爭中處于優(yōu)勢地位，導致某些菌種死亡。

圖3 不同接種體積分數(shù)對蛋白質降解率的影響Fig. 3 Effect of different inoculation amount on protein degradation rate

2.2.2 不同菌種配比對蛋白質降解率的影響混菌發(fā)酵時，菌種會有協(xié)同作用，也會抑制其他雜菌的生長。 當0 號菌與4 號菌質量比為1∶2 時，蛋白質降解率最高，為31.36%；當0 號菌∶4 號菌比例增大時，蛋白質降解率呈下降趨勢，見圖4。 這可能是由于混菌中的0 號菌為黏質沙雷氏菌，會產(chǎn)生一種具有生物活性的天然色素——靈菌紅素[24]。 研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素具有廣譜的殺菌能力，可高效殺死大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和新生隱球菌等多種細菌和真菌[25]。 可能在發(fā)酵過程中靈菌紅素抑制了其他微生物的生長，導致蛋白質的降解率下降。

圖4 不同菌種質量比對蛋白質降解率的影響Fig. 4 Effect of different mass ratio of strains on protein degradation rate

2.3 響應面優(yōu)化實驗

通過Design Expert 8.0 軟件對表3 實驗結果進行多元回歸擬合，根據(jù)實際因素建立二次多項式回歸方程：Y=56.32-0.069A+2.80B-1.18AB-2.92A2-8.30B2

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experimental

由表4 可知，模型方差分析P<0.05 顯著，失擬項P=0.213 9，不顯著，決定系數(shù)R2=0.984 1，R2adj=0.972 8， 表明該模型能夠解釋97.28%的關鍵因子對蛋白質降解的影響， 可用于預測蛋白質降解條件。 根據(jù)方程標準化回歸系數(shù)中一次項系數(shù)的絕對值（A=0.069，B=2.8）可以得出，所選2 個變量對蛋白質降解的影響大小為：B>A， 即菌種質量比>接種體積分數(shù)。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance of regression model

菌種質量比和接種體積分數(shù)呈向上凸包裹狀且等高線呈橢圓形， 說明其具有一定的交互作用，配比對蛋白質降解影響最大，但并未顯現(xiàn)出與其他因素的顯著交互作用， 見圖5。 通過Design Expert 8.0 軟件計算得出蛋白質降解的最佳發(fā)酵條件為：0號菌與4 號菌質量比為2.0∶1.7， 接種體積分數(shù)為1.98%；預測此時蛋白質降解率為56.56%。

圖5 兩因素交互作用對蛋白質降解率影響的響應面圖Fig. 5 Response surface diagram of the effect of the interaction of two factors on protein degradation rate

2.4 驗證實驗結果

2.4.1 不同發(fā)酵組對蛋白質、磷酸鹽、氨氮質量濃度的影響馬鈴薯淀粉汁水具有高泡沫性，會減少汁水中的溶氧量[1]，而利用好氧菌與厭氧菌相互作用，可減少單菌發(fā)酵時的動力消耗，加快蛋白質的降解速率。 利用最適發(fā)酵條件發(fā)酵馬鈴薯淀粉加工汁水，發(fā)現(xiàn)混菌的蛋白質降解率為65.32%，顯著高于單菌種發(fā)酵（P<0.05），說明混菌發(fā)酵性能顯著高于單菌發(fā)酵，見圖6。 在發(fā)酵過程中，磷酸鹽的質量濃度無論單菌發(fā)酵或者混菌發(fā)酵都有一定程度提高，混菌發(fā)酵時磷酸鹽質量濃度達2.86 mg/dL，較未發(fā)酵組顯著（P<0.05）升高，且顯著（P<0.05）高于單菌發(fā)酵，見圖7。 經(jīng)過微生物發(fā)酵，汁水中的磷酸鹽質量濃度升高， 可能是因為在微生物的作用下，汁水中部分有機磷被分解為磷酸鹽，使得汁水中磷酸鹽質量濃度增加。 氨氮質量濃度過高會引起水體富營養(yǎng)化，而少量的氨氮有利于植物生長，未發(fā)酵的馬鈴薯淀粉汁水中氨氮質量濃度為3.33 g/L， 顯著高于其他組（P<0.05）。汁水經(jīng)微生物發(fā)酵后，氨氮含量降低， 混菌發(fā)酵后汁水中氨氮質量濃度為1.63 g/L，較未發(fā)酵組降低51.05%，見圖8。 菌種在發(fā)酵過程中都能降低馬鈴薯淀粉加工汁水中的氨氮含量， 這可能是由于混菌由好氧菌與厭氧菌相組合，而這2 種菌種擁有硝化和反硝化微生物特性，能夠同時進行硝化和反硝化，從而有效降低了馬鈴薯淀粉汁水中氨氮的質量濃度。

圖6 蛋白質降解率驗證實驗Fig. 6 Verification experiment of protein degradation rate

圖7 磷酸鹽質量濃度驗證實驗Fig. 7 Verification experiment of phosphate content

圖8 氨氮質量濃度驗證實驗Fig. 8 Verification test of ammonia nitrogen content

2.4.2 不同發(fā)酵組對臭味物質的影響馬鈴薯淀粉廢水中含有大量的有機物質，是微生物生長的天然培養(yǎng)基， 當馬鈴薯淀粉加工汁水自然發(fā)酵時，會有大量的微生物聚集，其中蛋白質是微生物的主要有機氮來源，一些異養(yǎng)微生物可以產(chǎn)生胞外蛋白酶將其水解成可利用的氨基酸和寡肽，為自身提供營養(yǎng)，也可能為其他不能產(chǎn)生胞外蛋白酶的微生物提供營養(yǎng)[26]。 而蛋白質在水解過程中會產(chǎn)生具有刺激性臭味的硫化氫、氨氣，且有些氨基酸經(jīng)脫羧酶的作用會產(chǎn)生尸胺、腐胺等惡臭味物質。由表5 可知，未發(fā)酵的馬鈴薯淀粉汁水中尸胺質量濃度為4.72 mg/L，總生物胺質量濃度為9.66 mg/L，均顯著高于其他處理組（P<0.05），而通過混菌發(fā)酵馬鈴薯淀粉汁水中總生物胺僅含0.93 mg/L，且沒有產(chǎn)生尸胺等惡臭味物質。 單菌及混菌發(fā)酵的汁水中均未檢測到有吲哚、3-甲基吲哚、 硫化氫等刺激性惡臭味揮發(fā)物質，見表6。表明混菌在發(fā)酵馬鈴薯淀粉汁水降解蛋白質的同時沒有產(chǎn)生多余的惡臭味物質，所以該混菌可用于發(fā)酵降解馬鈴薯淀粉汁水，減少臭味物質的產(chǎn)生。

表5 驗證實驗中主要生物胺質量濃度Table 5 Main substance content in the verification experiment

2.4.3 不同發(fā)酵組對氨基酸、植物激素的影響有研究表明，胞外蛋白酶可能是通過一個或多個特定氨基酸或寡肽、或氨基酸和寡肽同時作為信號分子與膜傳感器相互作用，將信號傳遞到細胞中刺激產(chǎn)生的[24]。 表7 中混菌發(fā)酵后馬鈴薯汁水中氨基酸質量分數(shù)比單菌株發(fā)酵高，但沒有未發(fā)酵的高。 可能是由于菌株在發(fā)酵過程中將部分氨基酸轉化為其他物質，也可能菌種將氨基酸作為一種信號分子傳遞到細胞中產(chǎn)生胞外蛋白酶，從而減少了氨基酸的量。由表8 可知，經(jīng)混合菌發(fā)酵后汁水中吲哚乙酸-纈氨酸甲酯、氧化吲哚乙酸、吲哚乙酸-亮氨酸、3-吲哚乙酰胺等植物激素的質量濃度增高，因此該發(fā)酵汁水可能對植物生長有益。

表7 混菌發(fā)酵后馬鈴薯淀粉汁水中各氨基酸質量分數(shù)Table 7 Content of amino acids in potato starch juice after mixed bacteria fermentation

表8 混菌發(fā)酵后汁水中植物激素的質量濃度Table 8 Content of plant hormones in the juice after mixed bacteria fermentation

2. 5 黃瓜種子發(fā)芽結果

經(jīng)混菌發(fā)酵后的馬鈴薯淀粉加工汁水稀釋后對黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚軸長度的作用效果均最好，可有效促進黃瓜種子萌發(fā)，見表9。

表9 發(fā)芽結果Table 9 Germination results

可能是由于混菌發(fā)酵可將蛋白質降解為小分子氨基酸、氮磷等營養(yǎng)元素，更有利于黃瓜發(fā)芽過程中對營養(yǎng)物質的吸收。 因此，馬鈴薯淀粉加工汁水經(jīng)混菌發(fā)酵后進行適當稀釋，可有效促進黃瓜種子萌發(fā)，同時為使用該汁水進行還田灌溉提供了依據(jù)。

3 結 語

作者以苔蘚假單胞桿菌（4 號菌）與黏質沙雷氏菌（0 號菌）混合發(fā)酵馬鈴薯淀粉加工汁水，通過單因素和響應面實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，并對其進行營養(yǎng)物質與氣味分析。在15 ℃發(fā)酵48 h 的最適發(fā)酵條件為苔蘚假單胞菌：黏質沙雷氏菌質量比為1.7∶2.0，接種體積分數(shù)為1.98%。 在此優(yōu)化工藝條件下進行驗證實驗，結果表明：蛋白質降解率為65.32%，顯著高于單菌發(fā)酵 （P<0.05）； 磷酸鹽質量濃度為2.86 mg/dL，較未發(fā)酵組升高了18.67%；氨氮質量濃度較未發(fā)酵組降低了51.05%；且尸胺、組胺、色胺等生物胺未檢出，總生物胺質量濃度僅為0.93 mg/L，顯著低于其他處理組（P<0.05）；吲哚、硫化氫、3-甲基吲哚等惡臭味物質未檢出；同時混合菌在發(fā)酵過程中植物生長激素質量濃度增加， 且氨基酸含量豐富；將其進行一定稀釋后可以促進黃瓜種子的發(fā)芽，因此將好氧型苔蘚假單胞菌和厭氧型黏質沙雷氏菌混合應用于馬鈴薯淀粉加工汁水的發(fā)酵，可顯著提高蛋白質降解率和減少臭味物質產(chǎn)生，減少了對環(huán)境的污染，并對植物生長具有一定促進作用。