孫岑岑， 方 瑜， 董偉仁， 顧一峰

（浙江大學(xué)a.醫(yī)學(xué)院；b.動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

0 引 言

過(guò)氧化氫酶（catalase）是一類廣泛地存在于動(dòng)植物和微生物中的末端氧化酶，可將過(guò)氧化氫（H2O2）分解為氧氣和水，從而保護(hù)機(jī)體免受H2O2的傷害，是生物體防御保護(hù)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一［1-2］，并在食品、醫(yī)藥、化工等眾多領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值［3-5］。因此，對(duì)catalase活性的準(zhǔn)確測(cè)定是深入探究其生物學(xué)功能和擴(kuò)展其實(shí)際應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的catalase 活性測(cè)定通常采用高錳酸鉀（KMnO4）滴定法進(jìn)行［6-8］，但該方法存在很多問(wèn)題：滴定終點(diǎn)的判斷存在主觀差異性，易引入實(shí)驗(yàn)誤差；滴定反應(yīng)先慢后快，耗時(shí)較長(zhǎng)，且易造成實(shí)驗(yàn)失誤；KMnO4溶液配制程序繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程（強(qiáng)酸環(huán)境）存在安全隱患。

由此，本文利用魯米諾（Luminol）化學(xué)發(fā)光原理，改進(jìn)并建立基于Luminol 化學(xué)發(fā)光的catalase 活性檢測(cè)平臺(tái)，擬對(duì)新系統(tǒng)的測(cè)量穩(wěn)定性和靈敏度等進(jìn)行評(píng)估，以期實(shí)現(xiàn)catalase 酶活性的方便、快捷、安全的精準(zhǔn)測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)原理

在堿性條件下，利用Luminol 化學(xué)發(fā)光性被氧化劑（如H2O2）氧化生成Luminol 的激發(fā)態(tài)產(chǎn)物3-氨基鄰苯二酸（3-aminophthalate，3-AP），當(dāng)其返回到基態(tài)的過(guò)程中發(fā)出光子（λmax=425 nm）［9-10］，如圖1 所示。與KMnO4滴定法類似，Luminol 法測(cè)定酶活性的設(shè)計(jì)思路也是通過(guò)Luminol 被剩余H2O2氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的光強(qiáng)度確定H2O2剩余量，從而反推得到H2O2分解量，進(jìn)而計(jì)算出酶促反應(yīng)速度［11-12］。

本新型Luminol過(guò)氧化氫酶活檢測(cè)系統(tǒng)需滿足以下幾個(gè)條件：①Luminol被H2O2氧化產(chǎn)生的化學(xué)光強(qiáng)度與H2O2的摩爾濃度c（H2O2）有良好的線性關(guān)系；②化學(xué)光強(qiáng)度高，足以被常規(guī)儀器捕捉并記錄；③化學(xué)光達(dá)到峰值后可維持一定時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)操作提供時(shí)間窗，減少因操作時(shí)間的差異而帶來(lái)測(cè)量誤差，降低對(duì)設(shè)備的要求，提高可行性。

已有研究顯示，在過(guò)渡金屬（二價(jià)鈷Co（II）［13］，一價(jià)銅Cu（I）［13-14］，二價(jià)鐵Fe（II）［15］）和螯合劑（檸檬酸或乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA））存在的堿性硼酸緩沖液（pH8.5 ～10）中，Luminol被H2O2氧化產(chǎn)生的化學(xué)光可在幾分鐘內(nèi)達(dá)到峰值且穩(wěn)定持續(xù)一定時(shí)間（2 ～30 s），同時(shí)光強(qiáng)度與c（H2O2）在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，Luminol發(fā)光反應(yīng)過(guò)程如圖2 所示。對(duì)比不同過(guò)渡金屬和螯合劑對(duì)Luminol發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性的影響及實(shí)驗(yàn)操作的可行性、便捷性等［13］，本文選擇Co（II）作為過(guò)渡金屬，EDTA為螯合劑，并以前人研究成果為基礎(chǔ)［10，13］，進(jìn)行改良和優(yōu)化，設(shè)計(jì)并構(gòu)建基于Luminol/H2O2化學(xué)發(fā)光的catalase類的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定平臺(tái)（簡(jiǎn)稱Luminol/H2O2catalase檢測(cè)系統(tǒng)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Luminol/H2O2 catalase檢測(cè)系統(tǒng)的建立

（1）實(shí)驗(yàn)試劑的配制。①Luminol 發(fā)光液配制：100 mg/mL（0.56 mmol/L）Luminol溶液，用硼酸溶液（0.05 mol/L，pH 8.5 ～10.0）進(jìn)行配制；②反應(yīng)液A配制：Co（II）（4 mg/ml）的水溶液（Co（II）的硼酸溶液長(zhǎng)期放置易形成沉淀，不易保存，故配置為水溶液以便長(zhǎng)期保存）；③反應(yīng)液B 配制：含EDTA（10 mg/mL）的0.1 mol/L的硼酸溶液，其中pH 值在8.5 ～10之間，具體依據(jù)測(cè)定的c（H2O2）選擇；④H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液配置20 μmol/L ～10 mmol/L。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。曲線的繪制過(guò)程：①反應(yīng)預(yù)混液配制，將500 μL 反應(yīng)液A和500 μL 反應(yīng)液B充分混合，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；②取100 μL H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液加入10 μL PBS溶液（pH=7.0），混勻后，加入反應(yīng)混合液和100 μL Luminol 發(fā)光液；③利用Luminol化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀Berthold FB12-luminometer 檢測(cè)Luminol化學(xué)發(fā)光值（Chemiluminescence，CL），CL將在10 ～300 s 內(nèi)達(dá)到最大值，記錄最大值；④繪制c（H2O2）-CL標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2＞0.95 方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（3）catalase 活性檢測(cè)?；钚詸z測(cè)的過(guò)程：①用PBS稀釋catalase樣品至適合的摩爾濃度；配制反應(yīng)預(yù)混液；②取10 μL catalase樣品與100 μL已知摩爾濃度的H2O2混合，室溫反應(yīng)1 min 后，加入反應(yīng)預(yù)混液和發(fā)光液，此時(shí)酶促反應(yīng)終止，檢測(cè)CL；③利用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得CL 對(duì)應(yīng)的c（H2O2），推算得到H2O2消耗量，進(jìn)而得到該H2O2摩爾濃度下catalase 的反應(yīng)速度。實(shí)驗(yàn)中需注意，若H2O2消耗量大于5%，則應(yīng)對(duì)酶進(jìn)行稀釋，以確保得到的數(shù)據(jù)可真實(shí)反映酶促反應(yīng)初速度。

2.2 Lumino/H2O2 catalase 檢測(cè)系統(tǒng)的性能評(píng)估方法

2.2.1 適用范圍和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度

按照實(shí)驗(yàn)方法1 配制Luminol 發(fā)光、反應(yīng)液A 和pH分別為8.5、9 和10 的反應(yīng)液B，H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μmol/L ～10 mmol/L），參照1 中的方法測(cè)定并繪制不同pH值下的H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 catalase活力的測(cè)定

（1）反應(yīng)液終止酶促反應(yīng)的效果檢測(cè)。按上述2.1 的實(shí)驗(yàn)方法配制Luminol 發(fā)光、反應(yīng)液A，發(fā)光液B（pH 8.5），1 mmol/L H2O2溶液以及0.1μg/mL 的catalase溶液（Merk，2 000 ～5 000 U/mg）。其中：實(shí)驗(yàn)組I為H2O2（1 mmol/L，100 μL）+ PBS（10 μL）反應(yīng)2 min后立即加入反應(yīng)預(yù)混液和發(fā)光液進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)組II 為H2O2（1 mmol/L，100 μL）+catalase（1μg/mL，10 μL）反應(yīng)2 min，而后加入反應(yīng)預(yù)混液、發(fā)光液并進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)組III為H2O2（1 mmol/L，100 μL）+catalase（1μg/mL，10 μL）反應(yīng)2 min，與反應(yīng)預(yù)混液混合5 min而后再加入發(fā)光液進(jìn)行檢測(cè)。

（2）catalase 活力測(cè)定。按照上述2.1 的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定catalase活性，具體如下，配制1、2.5、5、7.5、10 mmol/L的H2O2溶液，反應(yīng)液B 調(diào)至pH =8.5，10 μL catalase溶液分別與不同摩爾濃度的H2O2溶液100 μL混合室溫反應(yīng)1 min，加入反應(yīng)預(yù)混液終止反應(yīng)并加入100 μL Luminol發(fā)光液，檢測(cè)并讀取CL 最大值，根據(jù)CL 計(jì)算反應(yīng)初速度，并利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法計(jì)算catalase的米氏常數(shù)Km值。

2.3 利用傳統(tǒng)KMnO4 法測(cè)定catalase酶活力

配制25% H2SO4溶液，0.01 mol/L KMnO4溶液，10 ～50 mmol/L H2O2溶液，1μg/mL的catalase 溶液。10 mL H2O2溶液（10 ～50 mmol/L）與100 μL catalase溶液混合，室溫反應(yīng)10 min 后立即加入2 mL 25%H2SO4溶液終止反應(yīng)，用0.01 mol/L KMnO4溶液滴定剩余的H2O2溶液至微紅色，記錄消耗的KMnO4體積，進(jìn)而推算反應(yīng)速率，并利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法測(cè)定catalase的Km值。

2.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS13.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，以p ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 Luminol/H2O2catalase 檢測(cè)系統(tǒng)適用范圍的確定

檢測(cè)體系的pH 對(duì)CL-H2O2線性關(guān)系有直接影響，為確定新檢測(cè)系統(tǒng)的使用范圍和測(cè)定準(zhǔn)確度，分別測(cè)定并繪制了pH =8.5、9.0、10.0 下，CL-c（H2O2）數(shù)據(jù)圖，分析CL 與c（H2O2）的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究相符，如圖3 所示。Luminol 發(fā)光強(qiáng)度與H2O2在0.02 ～10 mmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)非常好的線性關(guān)系，且不同pH 下，存在線性關(guān)系的H2O2c 范圍不同（pH=8.5：H2O21 ～10 mmol/L，R2=0.999 8；pH =9.0：H2O20.1 ～1 mmol/L，R2=0.993 5；pH =10.0：H2O240 ～200 μmol/L，R2=0.998 1；），即不同pH 的檢測(cè)體系適用于不同摩爾濃度范圍的H2O2的檢測(cè)，因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)酶活性選擇適宜的底物c（H2O2），進(jìn)而選擇適宜的緩沖液pH值。

圖3 不同pH值的檢測(cè)系統(tǒng)下CL與c（H2O2）的線性關(guān)系

3.2 Luminol/ H2O2 catalase檢測(cè)系統(tǒng)性能分析

catalase反應(yīng)速率的準(zhǔn)確測(cè)定，首先要保證反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，故反應(yīng)終止點(diǎn)需實(shí)現(xiàn)精確控制。傳統(tǒng)方法中通常利用濃硫酸終止酶促反應(yīng)，步驟繁瑣且存在安全隱患。新檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，catalase 和H2O2的混合液與反應(yīng)預(yù)混液混合5 min 后再加入發(fā)光液，檢測(cè)得到的光強(qiáng)度與立即加入反應(yīng)預(yù)混液、發(fā)光液所測(cè)得的光強(qiáng)度無(wú)明顯差異［見(jiàn)圖3（d）］，即H2O2的含量沒(méi)有顯著變化（p ＞0.05），說(shuō)明酶促反應(yīng)在加入反應(yīng)預(yù)混液后即被終止，故新檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)加入反應(yīng)預(yù)混液即可實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)的快速終止，方法簡(jiǎn)單、便捷，安全性高。

為評(píng)估新檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定質(zhì)量，利用該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)catalase酶活性進(jìn)行測(cè)定，并以KMnO4滴定法作為參照，如圖4 所示。結(jié)果顯示，Luminol/ H2O2catalase檢測(cè)系統(tǒng)獲得的反應(yīng)速率倒數(shù)（1/v）與底物摩爾濃度倒數(shù)（1/S）呈現(xiàn)顯著的線性關(guān)系（R2=0.998 3），重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)離散度小，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高，計(jì)算得到米氏常數(shù)Km=（12.4 ±0.11）mmol/L。而利用KMnO4滴定法得到的Km值明顯低于Luminol 系統(tǒng)（Km=（9.4 ±1.02）mmol/L，p ＜0.01），且1/v與1/S 的線性關(guān)系較差（R2=0.936 3），數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤較大，說(shuō)明新檢測(cè)系統(tǒng)可更加準(zhǔn)確和真實(shí)的反映catalase的活性。

圖4 不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的比較

此外，KMnO4滴定法對(duì)樣本量要求較高（1μg/mL catalase，100 μL），而新系統(tǒng)所需的catalase 量?jī)H是傳統(tǒng)方法的1/100（0.1μg/mL，10 μL），因此，本系統(tǒng)對(duì)待檢測(cè)樣品的活性和蛋白量要求較低，更適合于活性低，獲得量少的過(guò)氧化氫酶類蛋白樣品的測(cè)定。

4 結(jié) 語(yǔ)

本文以Luminol/ H2O2化學(xué)發(fā)光為原理，以Co（II）為過(guò)渡金屬、EDTA 為螯合劑建立Luminol/H2O2酶活檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)catalase 酶活力的準(zhǔn)確測(cè)定，并對(duì)該系統(tǒng)性能進(jìn)行了測(cè)評(píng)。結(jié)果表明，新系統(tǒng)測(cè)定精度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，可廣泛適用于對(duì)微量H2O2的摩爾濃度檢測(cè)及對(duì)包括catalase 在內(nèi)的具有分解H2O2能力的各種酶類的活力測(cè)定，為過(guò)氧化氫酶類的深入研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供重要的技術(shù)支持。同時(shí)該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，對(duì)樣本量、蛋白活性、操作技術(shù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低，在教學(xué)、科研以及工業(yè)等多領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值，值得推廣。