楊光至,劉梅芳,施 靜△,張如意,馮斯峰,徐連杰,趙曉慶,王 敏,王嘉輝

(1.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明 650021;2.云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500)

腦梗死已成為威脅人類健康的重大疾病[1],腦梗死導(dǎo)致的上運(yùn)動神經(jīng)元損害表現(xiàn)多樣,偏身骨骼肌肌力減弱是腦梗死患者骨骼肌的變化之一,在骨骼肌收縮過程中,Vmentin及desmin在維持肌肉細(xì)胞的骨架及細(xì)胞骨架的完整程度方面亦有一定作用。有研究運(yùn)用無標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用比較免疫印跡技術(shù),能夠在肌肉受損及肌肉的輕度退化中的對比鑒定出vimentin等蛋白的顯著改變[2],對研究小鼠肌肉收縮功能恢復(fù)與Vmentin的關(guān)系提供了佐證。desmin為中等徑細(xì)胞骨架纖維,對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支撐、細(xì)胞形狀的決定及細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的賦予等有重要作用[3]。高張力的機(jī)械牽拉會使細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響,進(jìn)而造成肌肉收縮蛋白的結(jié)構(gòu)破壞[4-6]。故在本研究中選取以上2個基因觀察針刺介入治療后mRNA的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)在建立腦梗死大鼠模型的基礎(chǔ)上,運(yùn)用qRT-PCR檢測法,觀察針刺對腦梗死大鼠不同骨骼肌中vimentin及desmin基因的表達(dá),以期進(jìn)一步探討針刺治療腦梗死的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重120 g,清潔級,共100只,由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供,并在本中心完成動物實(shí)驗(yàn),大鼠生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2014-0001;大鼠使用許可證:SYXK(浙)2014-0008,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,飼養(yǎng)于溫度18～26℃、濕度55%的環(huán)境中,自然光照。對動物的各項(xiàng)處理方式均按當(dāng)?shù)貏游锕芾砦瘑T會相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑 Trizol柱純化總RNA試劑盒(simgen)、Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit(with gDNase)(simgen)、2×SYBR Green PCR Mix(simgen)、50×ROX Reference Dye(simgen)。

1.3 主要儀器 水浴鍋(XMTD-6000,上海宜昌儀器紗篩廠);離心機(jī)(5452,德國eppendorf股份公司);ABI PRISM?7000熒光PCR儀(7000,美國ABI公司);漩渦振蕩儀(XH-C,金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.4 模型制備 采用孟宜良的線拴法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型[7],造模后的動物在自然蘇醒后,參照Zea-Longa的5級評分標(biāo)準(zhǔn)對其障礙進(jìn)行評分[8],篩選合格模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 動物分組與處理 按隨機(jī)數(shù)字表法分為:A組(頭部穴位組)、B組(軀體穴位組)、C組(頭部+軀體穴位組)、D組(模型組)、E組(空白組),每組20只,組內(nèi)再按隨機(jī)數(shù)字表法分為0、24、48 h組,每組5只。五組大鼠均正常喂養(yǎng)。

1.6 針刺方法 取穴和針刺手法參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》[9],選取“百會”、“風(fēng)府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴。針刺操作:“百會”向后斜刺2 mm,“風(fēng)府”向下方斜刺2 mm,“后三里”直刺7 mm,“前三里”直刺5 mm,“環(huán)跳”直刺7 mm,“后會”斜刺2 mm,“陽陵泉”直刺5 mm。針具選用佳健牌25號1寸一次性無菌針灸針;進(jìn)針后捻轉(zhuǎn)1 min,平補(bǔ)平瀉,每次留針30 min。

1.7 取材與檢測方法 各組針刺治療結(jié)束后,在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,取下前肢肌、腓腸肌針刺局部的骨骼肌,放入液氮中,隨轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存待測。采用反轉(zhuǎn)錄酶對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理;采用聚合酶及引物對反轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測。

采用定量法提取大鼠骨骼肌組織進(jìn)行異丙醇處理:(1)RNA提取:將大鼠骨骼肌標(biāo)本按Trizol試劑盒(simgen)操作說明提取RNA。(2)合成cDNA:將提取得到的RNA,各取2μg用于反轉(zhuǎn)錄,按照說明操作,-20℃凍存。(3)PCR擴(kuò)增:以一個樣本的cDNA稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品做基因的定量PCR,擴(kuò)增條件為95℃,1min變性,95℃,5s,60℃,33s,共40個循環(huán),最后是72℃,10min延伸。(4)引物:vimentin正向引物5’-TGAGATCGCCACCTACAGGA-3’5’-ACAATGCTTCTCTGGCAC GTCT-3’;desmin正向引物5’-TCACTCAACGAGGAGATTGCAT-3’5’-CATTGAGACCCGGGATG GAG-3’;內(nèi)參β-actin 正向引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’5’-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3’。(5)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)測得的樣品閾值(Ct)及標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出待測樣品的相對起始濃度,用目的基因的相對起始拷貝數(shù)除以相應(yīng)的β-actin的相對起始拷貝數(shù)得到目的基因表達(dá)的相對值。

2 結(jié)果

大鼠骨骼肌中vimentin及desminA的qRT-PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,并且擴(kuò)增產(chǎn)物符合設(shè)計(jì)長度。以樣本cDNA稀釋后求得的β-actin的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.366,相關(guān)系數(shù)為-0.996,模板濃度對數(shù)值與Ct之間呈良好的線性關(guān)系。

2.1 前肢肌中vimentin的表達(dá) 見表1,結(jié)果顯示,與模型組比較,三個治療組中vimentin的mRNA表達(dá)量均有明顯變化,頭部穴位加軀體穴位治療組在0、24 h有顯著性差異(P<0.001),較其余組別呈明顯上調(diào)。軀體穴位組在0、24 h有顯著性差異(P<0.001),表達(dá)量相對上調(diào)。

表1 前肢肌vimentin的mRNA表達(dá)比較

表2 腓腸肌中vimentin的mRNA表達(dá)的比較

2.2 腓腸肌vimentin的表達(dá) 結(jié)果顯示,與模型組比較,三個治療組中vimentin的mRNA表達(dá)量均有明顯變化,頭部穴位組加軀體穴位治療組在0 h有顯著性差異(P<0.001),較頭部穴位組及軀體穴位組表達(dá)量相對上調(diào)。軀體穴位組在24 h有顯著性差異(P<0.05),表達(dá)量明顯增高。模型組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),表達(dá)量在48 h時(shí)呈顯著上調(diào)。

2.3 前肢肌中desmin的表達(dá) 表3結(jié)果顯示:三個治療組中desmin 的mRNA表達(dá)量均有明顯變化,軀體穴位組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)。頭部穴位組在0、48 h均有顯著性差異(P<0.05),表達(dá)量在0 h相對上調(diào)。模型組在0、48 h有顯著差異(P<0.001),在48 h時(shí)表達(dá)量呈相對上調(diào)。

表3 前肢肌中desmin基因表達(dá)的比較

2.4 腓腸肌中desmin的表達(dá) 表4結(jié)果顯示:與模型組比較,三個治療組中desmin的mRNA表達(dá)量均有明顯變化,頭部穴位組加軀體穴位組在48 h有顯著性差異(P<0.001),表達(dá)量較其他組別呈現(xiàn)相對升高。軀體穴位組在0、24 h有顯著性差異(P<0.05),表達(dá)量均呈現(xiàn)相對上調(diào)。模型組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),48 h時(shí)表達(dá)量較之前明顯上調(diào)。

表4 前肢肌中desmin的mRNA表達(dá)的比較

3 討論

《素問·骨空論》曰“督脈者,起于少腹……貫脊屬腎……與太陽起于目內(nèi)毗,上額交巔上,入絡(luò)腦……”《難經(jīng)·二十八難》曰“督脈者起于下極之俞,并于脊里,上至風(fēng)府,入屬于腦貫脊屬腎;《十四經(jīng)發(fā)揮》曰“陽之海者,以人是脈絡(luò),周流于諸陽之分……而督脈為之都綱,故曰陽脈之海?！倍矫}是陽脈之海,能溝通陰陽,調(diào)節(jié)陽經(jīng)脈氣,總攝諸經(jīng),為經(jīng)脈之海,且能對腦的功能起到調(diào)節(jié)作用。膀胱經(jīng)、督脈經(jīng)都具有通行陽氣的作用。陽氣在人體中起著重要的作用,循經(jīng)達(dá)表,可以衛(wèi)外防御邪,通達(dá)于內(nèi),濡養(yǎng)臟腑,溫通經(jīng)脈……中風(fēng)病病變在腦部,以全身骨骼肌癱瘓等為臨床主要癥狀,而癱瘓肌群是督脈和膀胱經(jīng)脈所通過之處,經(jīng)絡(luò)所過,主治所及,故取督脈及膀胱經(jīng)的腧穴能升陽通督,改善全身骨骼肌肌力。許能貴等[10-11]通過電針大鼠局灶性腦缺血模型的督脈穴大椎、百會,發(fā)現(xiàn)電針可糾正腦缺血后中樞單胺類遞質(zhì)的代謝紊亂,進(jìn)而保護(hù)腦缺血性損害。易瑋等[12]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠在針刺大椎、百會后,局部腦血流量迅速恢復(fù),從而保護(hù)神經(jīng)元缺血性損傷。綜上所述,無論是現(xiàn)代研究及古代的醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)均證實(shí)了督脈經(jīng)穴和膀胱經(jīng)穴在中風(fēng)病治療中的重要作用,故本研究以督脈的風(fēng)府,百會為主穴,觀察腦梗死大鼠癱瘓骨骼肌中vmentin及desimin的mRNA表達(dá),以研究以督脈及膀胱經(jīng)穴為主治療中風(fēng)病的癱瘓骨骼肌的分子機(jī)制。

根據(jù)“治痿獨(dú)取陽明”的理論。以及現(xiàn)代研究,宿寶貴等[13]觀察到針刺足三里、曲池穴后在活體MRI下,大鼠的腦梗死區(qū)域面積較對照組明顯變小,且在電鏡下觀察到針刺足三里可使腦梗死邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的線粒體腫脹和嵴的損傷均比對照組輕微,提示針刺足三里可以對神經(jīng)元提供保護(hù)作用。 故本實(shí)驗(yàn)選取陽明經(jīng)的“前三里”和“后三里”觀察針刺對腦梗死大鼠骨骼肌的分子機(jī)制。

研究結(jié)果顯示:以督脈為主的頭部穴位+軀體穴位組,在腦梗死大鼠的前肢肌vimentin的表達(dá)量較其他組別在0、24 h出現(xiàn)了相對上調(diào),故頭部穴位加軀體穴位的早期針刺介入治療可能對腦梗死后骨骼肌的修復(fù)有一定作用;軀體穴位組較其他組別在0、24 h時(shí)desmin及vimentin的表達(dá)明顯上調(diào)。提示可能以軀體穴位的局部取穴為主的針刺,在維持局部骨骼肌細(xì)胞骨架的完整性及修復(fù)細(xì)胞骨架的方面較其他針刺方式效果更明顯;頭針組在0、24、48 h的desmin及vimentin的表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào);提示針刺頭部督脈經(jīng)穴,可能對于提高中樞腦組織的修復(fù)具有積極的作用,腦組織的修復(fù)的同時(shí)增強(qiáng)了骨骼肌的肌力恢復(fù)。

在研究中,筆者也觀察到,模型組在各骨骼肌肌群中,vimentin、desmin的mRNA表達(dá)量在48 h時(shí)上調(diào)的幅度相對較明顯,可能說明,在無針刺介入的情況下,骨骼肌正常細(xì)胞骨架可能具有自我修復(fù)的功能,提示可能針刺介入時(shí)間越早,對于骨骼肌細(xì)胞骨架及完整性的修復(fù)更具意義。

研究結(jié)果提示針刺改善腦梗死偏癱骨骼肌肌力的機(jī)制可能是通過針刺對外周效應(yīng)器的局部刺激,在改善局部功能的同時(shí),引起中樞腦組織的修復(fù),從而增強(qiáng)了外周效應(yīng)器的康復(fù),證實(shí)外周-中樞-外周的部分作用機(jī)制。