邵紫欣,汪 何,莫 偉,姜開文,王霜玲,周 琳,畢建璐△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510000;2.廣東省第二中醫(yī)院,廣東 廣州 510095;3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院,廣東 廣州 510515)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖是由胰島素分泌不足或其生物作用改變引起的,或兩者兼而有之。慢性高血糖可導(dǎo)致各種組織的慢性損傷,包括腎臟、眼睛、心臟、血管、神經(jīng)和功能障礙。根據(jù)國際糖尿病控制聯(lián)盟(IDF)的數(shù)據(jù),2019年全球約有4.6億成年人患有糖尿病。到2030年,這一數(shù)字預(yù)計(jì)將達(dá)到5.8億。超過90%的糖尿病患者患有2型糖尿病(T2DM)。T2DM主要表現(xiàn)為胰島素抵抗并發(fā)胰島素的相對不足,導(dǎo)致血糖水平升高,導(dǎo)致各種器官和組織慢性損傷,造成神經(jīng)、血管、腎臟疾病以及其他糖尿病并發(fā)癥,可能引起重病患者死亡[1]。T2DM的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。經(jīng)過對T2DM的廣泛研究,中醫(yī)在治療T2DM及其并發(fā)癥方面逐漸顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。尋求安全、有效、無不良反應(yīng)的傳統(tǒng)天然植物正逐漸成為T2DM研究的“熱點(diǎn)”[2]。

T2DM屬于中醫(yī)“消渴”的范疇,其病位在肺,胃,腎,主要病機(jī)陰津虧損,燥熱偏盛[3]。消渴病陰虛內(nèi)熱,耗傷津液,進(jìn)而導(dǎo)致血行不暢、血脈瘀滯。三芪丹針對T2DM “氣陰兩虛,瘀血阻滯”的病理環(huán)節(jié),遵循中醫(yī)益氣養(yǎng)陰,活血化瘀的治法原則,主要針對氣陰兩虛,瘀血阻滯所致口干多飲善饑,小便頻數(shù),疲倦乏力,腰膝酸軟等[4]。三芪丹的主要藥物組成為三七,黃芪,丹參,桑椹。三七是五加科植物三七的干燥根和根莖,能夠化瘀止血、活血定痛。相關(guān)研究表明,三七對T2DM模型大鼠具有降血糖、提高胰島素抵抗和減少并發(fā)癥的功用[5]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。黃芪為甘溫之品,歸于肺經(jīng)、脾經(jīng),具有補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血、利水消腫等功效。有研究表明單味黃芪可以提高T2DM患者的胰島素抵抗、減弱早期胰島β細(xì)胞損害[6]。丹參味苦、微寒,祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為丹參可活血祛瘀、清心除煩、通經(jīng)止痛、涼血消癰。有研究表明,丹參在降低血糖水平方面有很好的效果,臨床證實(shí)了丹參治療糖尿病及其并發(fā)癥的功效[7]?！吨袊幍洹酚涊d桑椹可以補(bǔ)血滋陰,生津潤燥,1988年國家衛(wèi)生部將桑椹列為藥食同源植物,被稱為“21世紀(jì)的最佳保健果品”,是一種治療高血壓、高脂血癥和糖尿病的特殊藥食兩用植物,得到了國內(nèi)心血管病專家的一致評價(jià)。本文旨在通過對三芪丹進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,為T2DM的治療提供進(jìn)一步的方法依據(jù)和機(jī)制,從三芪丹的有效化合物、有效化合物和靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)和疾病之間的機(jī)制進(jìn)行分子水平的細(xì)化?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點(diǎn)的篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(TCMSP)[8]找到三七,黃芪,丹參,桑葚的中藥成分,并根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%,藥物相似性(DL)≥0.18 篩選出主要化合物和靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫以“Type2 diabetes”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲得T2DM相關(guān)的疾病靶點(diǎn),并應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫對疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,獲得Uniprot ID。將三芪丹主要化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過Venny2.1軟件繪制韋恩圖取交集,得到三芪丹治療T2DM的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的藥物-疾病共同靶蛋白在STRING 11.0平臺構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,將蛋白質(zhì)種類設(shè)置為“Homo sapiens”,置信度為:highest confidence(0.900),其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲得的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2[9]中構(gòu)建藥物主要化合物-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò),并利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality(MCC)拓?fù)浞治龇椒ǖ玫饺蔚ぶ委烼2DM前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 功能富集分析及“成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用RStudio及metascape數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站分別分析三芪丹治療T2DM相關(guān)靶點(diǎn)的基因功能及代謝通路。利用得到的藥物-疾病靶基因進(jìn)行GO(Gene ontology)生物過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)代謝通路富集分析(選擇P≤0.05),分析三芪丹治療T2DM的信號通路和生物過程。最后應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建三芪丹主要成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D。

2 結(jié)果

2.1 三芪丹主要化合物和靶點(diǎn)的篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫找到三七,丹參,黃芪,桑椹的中藥成分,并根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%,藥物相似性(DL)≥0.18 篩選出主要化合物99個(gè),其中三七8個(gè),丹參65個(gè),黃芪20個(gè),桑椹6個(gè),刪除重復(fù)項(xiàng)后得到97個(gè)主要化合物,見表1(按OB值大小排列,藥物僅列出排名前4位的化合物)。將主要化合物輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢得到潛在作用靶點(diǎn),經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫匹配后得到對應(yīng)靶點(diǎn)314個(gè)(已去除重復(fù)項(xiàng))。

表1 三芪丹主要化合物表

2.2 三芪丹治療T2DM的潛在作用靶點(diǎn) 通過TTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,獲得T2DM相關(guān)疾病靶點(diǎn)172個(gè)(已去除重復(fù)項(xiàng))。將314個(gè)三七,丹參,黃芪,桑椹成分靶點(diǎn)與172個(gè)T2DM靶點(diǎn)輸入Venny2.1軟件繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得三芪丹與T2DM共同靶點(diǎn)18個(gè),見圖1。

圖1 三芪丹與T2DM共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.3.1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING在線數(shù)據(jù)輸入18個(gè)潛在靶點(diǎn),分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2,圖中

圖2 三芪丹潛在靶點(diǎn)的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

含有18個(gè)靶蛋白和40條互作邊。將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中,利用CytoHubba插件中的MCC算法篩選最重要10個(gè)關(guān)鍵基因,見圖3。這些關(guān)鍵基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)、受體酪氨酸蛋白激酶(ERBB2)、干擾素-γ(IFNG)、SLC2A4、雄激素受體(AR)、間隙連結(jié)α-1(GJA1)。

2.3.2 三芪丹主要化合物-治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape軟件構(gòu)建三芪丹主要化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),merge后得到79個(gè)節(jié)點(diǎn),171條邊,見圖4。從圖4可知,一個(gè)化學(xué)成分常與多個(gè)交集基因靶點(diǎn)對應(yīng),且一個(gè)交集基因與靶點(diǎn)也同時(shí)對應(yīng)多個(gè)化學(xué)成分,化學(xué)成分又從屬于不同的中藥,這說明三芪丹治療T2DM是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路起效的。以“degree”排序后得到,有效成分槲皮素、木犀草素、二氫丹參內(nèi)酯、刺芒柄花素、山柰酚和靶點(diǎn)PTGS1、DPP4、AR、DRD1、PPARG、PIK3CG。

圖4 三芪丹主要化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 功能富集分析

2.4.1 GO富集分析 基于Bioconductor中的R包對18個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)功能富集分析。富集條件為P valueCutoff=0.05且Q valueCutoff=0.05,其他項(xiàng)目默認(rèn)原始設(shè)置。共得生物過程(biological process,BP)1214個(gè),分子功能(molecular function,MF)31種,細(xì)胞組成(cellular component,CC)4種,共1249條信息。其中GO富集生物進(jìn)程分析中交集基因主要參與了對肽激素的反應(yīng)、RNA分解代謝、肽的細(xì)胞反應(yīng)、mRNA分解代謝過程等生物過程,見圖5。

圖5 三芪丹-T2DM潛在靶點(diǎn)的生物功能分析

2.4.2 KEGG信號通路富集分析 KEGG通路富集通路(P<0.05),主要涉及癌癥通路、破骨細(xì)胞分化、foxo信號通路、PPAR信號通路、胰島素抵抗等,選擇前9個(gè)進(jìn)行圖形展示,結(jié)果見圖6,提示可能是三芪丹-T2DM的主要生物學(xué)功能及作用機(jī)制。

圖6 三芪丹-T2DM潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 “成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將三芪丹治療T2DM的61個(gè)潛在成分,18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白及KEGG信號通路富集分析的前9條通路制作“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建出三芪丹治療T2DM的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖7。體現(xiàn)了三芪丹中“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”對T2DM起到綜合治療作用的特點(diǎn)。

圖7 三芪丹治療T2DM的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

T2DM是一種慢性代謝疾病,主要是由于相對缺乏胰島素和胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、木犀草素、二氫丹參內(nèi)酯、刺芒柄花素、山柰酚是三芪丹最重要、最有效的化合物,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)是三芪丹治療T2DM的關(guān)鍵靶點(diǎn)。大量研究表明槲皮素具有氧化、抗炎、降低血糖等多種生物活性,可在糖尿病防治中發(fā)揮作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均屬于黃酮類化合物,有實(shí)驗(yàn)表明,補(bǔ)充槲皮素有利于降低糖尿病大鼠的血糖濃度,促進(jìn)胰島β細(xì)胞的恢復(fù)并增加胰島素的釋放[10]。其作用機(jī)制可能是由于槲皮素皮質(zhì)激素有助于增加胰島素受體數(shù)量,刺激胰腺β細(xì)胞再生,修復(fù)胰腺氧化損傷,清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,改善氧化劑-抗氧化劑以維持正常糖之間的平衡[11]。山柰酚不僅能降低血脂和血糖,保護(hù)胰島素的細(xì)胞功能,提高胰島素抵抗力,還可以保護(hù)糖尿病微血管病變[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,木犀草素能顯著改善脂質(zhì)含量升高引起的大鼠胰島素抵抗模型,具有抗T2DM的活性[13-14]。木犀草素對實(shí)驗(yàn)動物血糖活性增強(qiáng),可顯著提高T2DM對胰島素的抵抗力[15]。有研究表明刺芒柄花素作為一種多酚類化合物,激活PPARγ通道調(diào)節(jié)血脂代謝[16-17]。在動物實(shí)驗(yàn)中,刺芒柄花素可以降低胰島素抵抗力,改善糖尿病大鼠的血糖和脂質(zhì)水平,降低T2DM血糖水平,可能由于SIRT1在胰腺組織中的表達(dá)增加[18]。二氫丹參內(nèi)酯是丹參T2DM的關(guān)鍵化合物,二氫丹參內(nèi)酯在T2DM中治療中的相關(guān)研究較少。

在三芪丹作用T2DM的18個(gè)靶點(diǎn)中,Degree最高的靶點(diǎn)分別是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)。T2DM的發(fā)生機(jī)制可能與磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)等相關(guān)。PPARG在脂肪細(xì)胞的分化、脂肪細(xì)胞異質(zhì)基因的表達(dá)以及胰島素敏感性的調(diào)節(jié)中起著重要作用,或許參與T2DM對脂肪紊亂的調(diào)節(jié)[19]。研究表明,PTEN參與調(diào)節(jié)胰島素T2DM P3K-AKT信號傳導(dǎo)通道,在T2DM出現(xiàn)之前發(fā)生了變化,這可能是T2DM早期生化檢測的指標(biāo)[20]。SIRT1是一種多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,通過使多種控制代謝及內(nèi)分泌信號的轉(zhuǎn)錄因子脫乙酰基而調(diào)節(jié)其活性,調(diào)節(jié)身體的能量平衡,維持體內(nèi)糖的穩(wěn)定代謝[21]。

通過對核心靶蛋白進(jìn)行GO和KEEG通路富集分析,三芪丹治療T2DM中涉及多個(gè)生物過程和多個(gè)通路的共同協(xié)調(diào)作用。筆者發(fā)現(xiàn)三芪丹對治療 T2DM的靶點(diǎn)可能包括以下四類機(jī)制:(1)破骨細(xì)胞分化。(2)foxo信號通路。(3)PPAR信號通路。(4)胰島素抵抗。破骨細(xì)胞分化是導(dǎo)致T2DM骨質(zhì)疏松癥,血糖、胰島素、去卵巢、雌激素等缺乏的原因之一[22],有研究表明,在糖尿病骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)破骨細(xì)胞通過激活ROS/MAPKs/NF-ΚB/NLRP3炎癥通路以及抑制胞葬作用發(fā)生介導(dǎo)骨吸收能力的增強(qiáng)是糖尿病性骨質(zhì)疏松的主要發(fā)病機(jī)制[23]。foxo信號傳導(dǎo)通路,FOXO在調(diào)控糖脂代謝、細(xì)胞周期和氧化應(yīng)激中起著重要作用,主要通過轉(zhuǎn)錄控制和信號傳遞[24],foxo在調(diào)節(jié)糖尿病、腫瘤等多種復(fù)雜疾病中發(fā)揮重要作用。foxo是通過PI3K通道激活的,PI3K通道通過生長因子作用激活,可導(dǎo)致磷酸化AKt激活,磷酸化的foxo激活或抑制細(xì)胞凋亡或細(xì)胞分裂周期相關(guān)基因,如FasL,Bcl26,TRAIL,FLIP等,要么促進(jìn)凋亡,要么抑制凋亡[25]。已有研究證明foxo3a轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)皮細(xì)胞中通過PI3K/Akt/foxo3a途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。過氧化物酶增殖激活受體(PPAR-λ)是與糖尿病及脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的基因,與其下游解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)-腺苷酸活化激酶 AMPK-ACC信號通路共同參與肝臟相關(guān)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)[26]。實(shí)驗(yàn)表明,PPAR信號通路與糖脂代謝相關(guān),電針通過PPAR-γ/UCP2-AMPK-ACC信號通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,提高T2DM大鼠體內(nèi)胰島素抵抗力[27]。

本研究通過中藥活性成分分析、靶向預(yù)測,分析T2DM治療的相關(guān)機(jī)制,通過網(wǎng)絡(luò)模擬分析,從“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的相關(guān)性以及槲皮素、木犀草素、山萘酚等多種活性成分的測定,影響破骨細(xì)胞分化、foxo信號通路、PPAR信號通路、胰島素抵抗等,發(fā)揮調(diào)控糖脂代謝、提高胰島素敏感性、提高胰島素抵抗等作用。本研究發(fā)現(xiàn)三芪丹治療T2DM呈現(xiàn)出的多分子、多靶點(diǎn)協(xié)同作用優(yōu)勢明顯,并為進(jìn)一步拓展研究提供了臨床方法論和理論依據(jù)。