王星敏, 商璇

南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室(廣東廣州 510515)

地中海貧血(簡稱地貧)屬于血紅蛋白病,是一種全球廣泛分布的遺傳性血液病。長江以南的省份是我國的地貧高發(fā)區(qū),尤以廣西、廣東及海南的發(fā)病率最高[1]。地貧發(fā)病是由于珠蛋白基因點突變或缺失導致珠蛋白合成受阻,引發(fā)紅細胞內珠蛋白鏈比例失衡,進而引起溶血、無效造血和鐵過載等一系列病理生理變化。根據(jù)減少的珠蛋白類型,地貧可以分為α-地貧和β-地貧[2-3]。地貧個體臨床表型嚴重程度與其基因型相關,地貧攜帶者無明顯臨床癥狀,而重型地貧患者若未能進行規(guī)范治療可能在胎兒期或兒童期死亡[4]。既往研究顯示[5],全世界每年可能有超過56 000例新生兒患有地貧,因此地貧的預防是世界范圍內的公共衛(wèi)生問題。目前臨床大多數(shù)地貧患者仍采用規(guī)律輸血和祛鐵的常規(guī)治療手段。但此類常規(guī)療法需終身進行,花費較高,給受影響家庭帶來沉重經(jīng)濟負擔。所以對育齡人群進行婚檢或通過產(chǎn)前篩查發(fā)現(xiàn)同型地貧攜帶者的高風險夫婦,再結合產(chǎn)前診斷預防地貧患兒出生是高發(fā)區(qū)較為通用的公共衛(wèi)生政策?，F(xiàn)行地貧的一線篩查是血液學表型分析,主要包括紅細胞指標測定和血紅蛋白(Hb)分析,必要時結合鐵代謝水平的檢測分析[6]。醫(yī)務人員根據(jù)篩查結果指導夫婦是否需要進一步進行地貧基因檢測。本文將對地貧表型篩查的相關指標的影響因素進行系統(tǒng)的歸納和總結,希望能使醫(yī)務人員對地貧篩查指標有更深刻的認識和理解,從而更準確地解讀篩查結果和進行下一步的基因檢測。

1 血液學表型篩查是目前地貧人群篩查的一線方案

地貧人群篩查的目的是為了提早發(fā)現(xiàn)同為地貧攜帶者有孕育嚴重地貧患兒風險的夫婦并為其提供關于如何避免這樣一種不利事件的有效選擇。高發(fā)區(qū)地貧人群篩查根據(jù)策略可以分為基于臨床血液學指標的表型篩查和基于遺傳學基因檢測的分子篩查兩種。由于基因檢測的儀器、試劑和人力成本高,在基層醫(yī)療機構較難普及。所以結合我國實際情況,目前高發(fā)區(qū)的地貧人群篩查主要采用表型篩查策略。地貧個體的外周血紅細胞呈現(xiàn)大小不均、并有異形紅細胞出現(xiàn)、網(wǎng)織紅細胞增多現(xiàn)象,具有典型的小細胞低色素性變化。這些血液學表型改變是我們在人群篩查中發(fā)現(xiàn)地貧攜帶者個體的參考依據(jù)。

地貧血液學表型分析主要包括紅細胞指標的測定和血紅蛋白組成分析,必要時輔以鐵代謝狀態(tài)的分析。血液學表型分析的準確度是指導后續(xù)采用DNA診斷方法鑒定地貧個體基因型的基本前提。目前用于紅細胞指標測定的血細胞自動分析儀和用于血紅蛋白分析的全自動血紅蛋白分析儀均為高通量自動化設備,可滿足大人群地貧攜帶者篩查的需要。在上述血液學表型分析結果的指導下,借助分別針對不同類型地貧的DNA診斷技術,可以準確、快速地確認地貧基因攜帶者個體。

2 血液學表型篩查的主要指標

地貧的血液學特征是小細胞[平均紅細胞體積(MCV)]低色素[平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)],伴有Hb A2和胎兒血紅蛋白(Hb F)的含量發(fā)生變化,有些攜帶特殊地貧突變的個體還出現(xiàn)特征性的異常血紅蛋白如血紅蛋白Constant Spring(Hb CS)和血紅蛋白E(Hb E)等。因此血液學表型篩查的主要指標是包括紅細胞參數(shù)(MCV和MCH)的測定和血紅蛋白組成分析(異常血紅蛋白檢測、Hb A2和Hb F定量)。紅細胞指標測定一般采用血細胞自動分析儀(即當前常規(guī)使用的三分類或五分類全自動血液分析儀),操作為采集EDTA抗凝血,按儀器說明上機,自動輸出檢測值。血紅蛋白分析主要采用兩種方法:高效液相色譜分析和毛細管電泳。兩種方法均以EDTA抗凝全血為檢測標本,可由相應高通量自動化儀器完成。前者的代表是Bio-Rad公司的VARIANTTM Ⅱ分析系統(tǒng),根據(jù)不同血紅蛋白在色譜柱中洗脫時間的差異進行種類定性。后者的代表是Sebia公司的CAPILLARYS系統(tǒng),根據(jù)不同血紅蛋白等電點、分子大小和形狀不同,從而在電場中移動速率不同進行種類定性。

MCV代表平均紅細胞體積,成人MCV的正常范圍是80～100 fL;MCH代表紅細胞的平均血紅蛋白含量,MCH的正常范圍是27～31 pg[7]。地貧的檢測結果一般顯示MCV<80 fL和(或)MCH<27 pg,這是常規(guī)地貧指南建議的篩查臨界值。個體出現(xiàn)上述結果提示有患地貧或缺鐵性貧血的可能,因此可輔助檢測血清鐵蛋白等指標,用于評估鐵代謝狀態(tài)從而進一步鑒別診斷[8-9]。此外,紅細胞參數(shù)中的紅細胞分布寬度(RDW)值也有一定作用。RDW反映紅細胞大小變異程度,可輔助地貧和缺鐵性貧血的鑒別診斷,但是不能作為單獨鑒別地貧的指標。一般情況下,地貧表現(xiàn)為大小較均一的小紅細胞,RDW正常或稍高,而需與之鑒別的缺鐵性貧血則表現(xiàn)為紅細胞大小不一,RDW數(shù)值升高[3,8]。

血紅蛋白組分分析主要檢測外周血樣本中Hb A、Hb A2、Hb F和異常血紅蛋白等水平。正常成人體內有3種血紅蛋白,包括Hb A(α2β2)、Hb A2(α2δ2)和Hb F(α2γ2)。Hb A是血紅蛋白的主要成分,占總量的96%以上。其次是Hb A2,占總量的2.5%～3.5%,Hb F(α2γ2)不到1%。Hb A2,即成人次要血紅蛋白,它是一種由2條α肽鏈和2條δ肽鏈構成的四聚體結構。α2δ2四聚體的合成約開始于妊娠第30周的胎兒,在出生時,該四聚體占總血紅蛋白的0.5%,之后持續(xù)增加,直到出生后6個月,達到成人水平,并維持在2.5%～3.5%之間[2]。雖然Hb A2的生物學功能未知,但是Hb A2水平可用于指導地貧分型。針對采用的具體檢測技術,Hb A2正常范圍的參考值可能會有變化,以儀器條件為準。Hb F,即胎兒血紅蛋白,是一種由2條α肽鏈和2條γ肽鏈構成的四聚體結構,主要在胎兒期表達,通常在出生2歲后低于1%,對于Hb F>2%的成人應接受進一步檢查[6]。Hb F的升高可能與特異性δβ或γδβ基因缺失、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合征(HPFH)、Gγ或Aγ基因啟動子上的點突變、紅細胞生成應激反應、使用特定細胞毒性藥物(如羥基脲)治療、骨髓惡性腫瘤、再生障礙性貧血或妊娠有關[10]。在MCH≤27 pg的情況下,Hb F升高(>5%)提示δβ-地貧的可能;在MCH正常的情況下,應考慮HPFH的存在[11]。臨床上Hb F水平升高可用于緩解中重度地貧患者表型,因此大量研究致力于發(fā)現(xiàn)調控Hb F升高的因子[10]。

紅細胞參數(shù)和血紅蛋白分析二項檢測的不同結果組合可大致劃分出不同類型的血紅蛋白病,見表1。值得注意的是,在少數(shù)特殊類型珠蛋白基因突變的攜帶者,或地貧個體合并其他疾病時,可使上述檢測結果發(fā)生變化,此時單純依靠篩查結果易于發(fā)生漏診或誤診。對于疑難病例需要應用基因分子檢測技術進一步明確診斷。

表1 各類型血紅蛋白病基因攜帶者血液學表型分析診斷標準

3 MCV、MCH和Hb A2的應用及影響因素

3.1 MCV和MCH MCV是最常用的地貧篩查血液學指標之一。根據(jù)MCV值,可將貧血類型分為小細胞性貧血(MCV<80 fL)、正細胞性貧血(MCV在80～100 fL間)以及大細胞性貧血(MCV>100 fL)[12]。由于長期慢性貧血和無效造血,地貧個體的紅細胞體積縮小,呈小細胞樣改變,所以地貧篩查中MCV陽性的界定參考值一般為80 fL。但是,地貧具有高度的臨床表型異質性,很多α+-地貧突變(如-α3.7和-α4.2)攜帶者的MCV值接近臨界值[7]。因此在某些地貧高發(fā)地區(qū),為了盡可能納入地貧攜帶者,MCV篩查的臨界值可提高到82 fL[1]。一項香港地區(qū)的地貧攜帶者的群體調查顯示,在1 727例受試者中,95例的MCV值處于80～85 fL之間,其中32例攜帶α+-地貧突變(23例攜帶-α3.7突變,8例攜帶-α4.2突變,1例攜帶Hb CS突變),3例攜帶β-地貧突變(均為Hb E)[13]。這一結果顯示,即使將MCV篩查的臨界值提高到82 fL,仍有一定可能漏檢。事實上,既往研究[7]表明,許多α+-地貧雜合子不會出現(xiàn)明顯的紅細胞參數(shù)改變;而α0-地貧雜合子通常表現(xiàn)明顯的MCV降低。所以,僅依靠MCV值進行地貧攜帶者篩查,容易漏檢α+-地貧雜合子,可能會導致部分HbH病患兒出生。此外,在地貧高發(fā)區(qū),存在一定數(shù)量的α+-地貧合并β-地貧的雙重雜合子,此類個體如果由于MCV值高于參考值而不進行下一步的基因檢測,也有可能導致中間型或重型β地貧患兒的出生。醫(yī)務人員在進行篩查時應對此類情況的發(fā)生有風險預期。

另外,紅細胞體積受到多重因素的影響,以下的特殊情況可能造成個體的紅細胞體積發(fā)生變化,影響MCV的測定,從而干擾地貧篩查結果,需要額外警惕。常用的腫瘤藥物之一酪氨酸激酶抑制劑(如舒尼替尼、伊馬替尼等)可影響服藥個體的MCV水平[14-15]。一項對接受舒尼替尼治療的179例成人和21例兒童實體瘤患者進行的回顧性研究發(fā)現(xiàn),無論在成人組還是兒童組,接受20周左右的舒尼替尼治療后,個體的MCV值均出現(xiàn)明顯提高[16]。該項研究并指出,MCV升高可以作為評估舒尼替尼療效的指征。因此,若地貧攜帶者使用該類藥物,可能會導致個體的MCV值變化,影響篩查結果。外周血樣本中紅細胞碎片增多同樣會影響MCV檢測。在一個巨幼紅細胞增多癥的英國病例中,患者的MCV檢測值為81.5 fL,但外周血涂片顯示存在大量紅細胞碎片和橢圓形大細胞。進一步診斷確定其患有巨幼紅增多癥,MCV值實際為106 fL[17]?？梢?隨著紅細胞碎裂增加,采用儀器測定的MCV值不一定準確。接受抗逆轉錄病毒治療也會影響個體的MCV值,接受此類治療后個體的MCV值會升高,這可能顯著影響地貧篩查。一項接受高效抗逆轉錄病毒治療的臺灣人群的隊列研究中,包括74例地貧攜帶者孕婦和58例非地貧攜帶者孕婦;當未接受抗逆轉錄病毒治療治療時,以MCV<80 fL篩查地中海貧血攜帶者,篩查敏感度為83.3%,當接受治療后,篩查敏感度降為33.3%,假陰性率為66.7%;若使用MCV<80 fL作為篩查地貧的臨界值,2/3接受治療4周的地貧攜帶者將表現(xiàn)為假陰性。所以,接受抗逆轉錄病毒治療期間的MCV值也不能用于地貧篩查[18]。

MCH亦是一項常用的地貧篩查血液學指標,當MCH<27 pg時,稱為低色素癥,臨床常見于地貧和缺鐵性貧血。因MCH數(shù)值穩(wěn)定性更高,且不易受到外界環(huán)境影響,MCH值在地貧診斷上比MCV值更可靠[6]。盡管MCV和MCH與疾病表型嚴重程度有一定相關性,但是MCH和MCV的數(shù)值變化并不一定與疾病嚴重程度成正比,因此不能單純的依據(jù)MCV和MCH水平來判斷地貧表型嚴重程度[6]。研究表明,MCV和MCH作為單一標志物,具有顯著優(yōu)于Hb A2的敏感度、特異度和診斷準確性[19]。MCV+MCH聯(lián)合篩查是整體初篩最佳的策略,MCV+MCH聯(lián)合篩查在保持較高敏感度的情況下,還顯著提高了篩查特異度,減少漏診。MCV+MCH+Hb A2是目前使用最廣泛的策略,對于β-地貧來說是目前綜合效益最優(yōu)的篩查策略[19]。

3.2 Hb A2Hb A2含量是一項鑒別α-地貧和β-地貧的特異性篩查指標。近年來,高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE)技術已被廣泛用于臨床實驗室中Hb A2的定量測量。α-地貧由于α-珠蛋白鏈合成減少,一般表現(xiàn)為Hb A2降低,通常以Hb A2<2.5%作為可疑α-地貧的參考值;β-地貧則由于β-珠蛋白鏈合成減少導致Hb A2增高,一般以Hb A2>3.5%作為可疑β地貧的參考值[19]。然而,既往研究表明,Hb A2>3.5%作為β-地貧的篩查截斷值有較高的敏感度和特異度,而Hb A2<2.5%作為α-地貧篩查的界值結果并不理想,即使調整界值后,檢測敏感度改變不大,但是特異度卻明顯降低[19-20]。在一項對1 178對孕前檢查夫婦進行的地貧篩查研究中,以Hb A2>3.5%為界,可篩查出91.3%的β0-地貧雜合子和94.74%的β+-地貧雜合子;而以Hb A2<2.5%為界僅能篩查出30.19%的靜止型α-地貧個體和66.07%的標準型α-地貧個體[20]。該研究中,使用Hb A2>3.5%,β-地貧的檢測敏感度94.17%,其特異度、陽性和陰性預測值均>80%;但Hb A2含量用于α-地貧篩查的敏感度極低,因為47%的α-地貧攜帶者的Hb A2介于2.5%～3.5%[20]。另一項對11 428例福建地區(qū)疑似地貧個體的篩查研究中[21],中間型α-地貧的Hb A2最佳閾值為1.75%,其特異度及敏感度均較高,而靜止型α-地貧和標準型α-地貧的Hb A2最佳閾值分別為2.95 %和2.55%,此時雖然篩查的敏感度較高,分別為96.3%和87.7%,但是特異度較低,不能作為臨床篩查的界值。以上人群評價的結果[19-22]顯示,可以使用Hb A2>3.5%作為界值進行β-地貧個體篩查,但Hb A2定量檢測并不適用于進行α-地貧篩查。

Hb A2水平同樣受到多重因素的影響,以下的特殊情況可能造成個體的Hb A2水平發(fā)生變化,影響Hb A2的測定,從而干擾地貧篩查結果?？稍斐杉t細胞內Hb A2水平減低的因素包括:(1)鐵缺乏可降低Hb A2水平。當機體鐵缺乏時,α-珠蛋白肽鏈與β-珠蛋白肽鏈的結合趨勢高于δ-珠蛋白肽鏈,或者低水平的鐵會抑制δ-珠蛋白合成,因此重度缺鐵性貧血可顯著降低Hb A2水平,最高可下降0.5%[11,23]。(2)個體患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤如青少年慢性髓系白血病、急性髓系白血病[24]。一項關于青少年慢性髓系白血病的案例研究中,記錄了9例嬰幼兒患者的Hb A2數(shù)據(jù),其中,8例患兒Hb A2顯著降低,均低于1%,1例患兒Hb A2處于正常低值水平(2.4%～3.1%)[25]。升高Hb A2水平的因素包括:(1)接受抗逆轉錄病毒治療。一項對HIV陽性夫婦進行抗逆轉錄病毒治療的研究發(fā)現(xiàn),接受治療后男性個體的MCV和MCH均處于正常水平,而Hb A2水平升高至4%[26]。另一項研究對印度地區(qū)HIV陽性成年人的地貧篩查數(shù)據(jù)進行了回顧性分析[27]。該研究包括78例HIV陽性的成年人,產(chǎn)前女性70例和男性8例。55例接受抗逆轉錄病毒藥物治療的患者中有14例Hb A2水平達到β-地貧篩查陽性界值(平均3.7%);應用抗逆轉錄病毒藥物齊多夫定和司他夫定的HIV陽性患者,MCV、MCH和Hb A2水平均升高,這點在前文MCV升高的影響因素中也有闡述。(2)個體攜帶其他基因突變。例如KLF1和SUPT5H。在一項對145例意大利撒丁島人Hb A2水平的調查研究中,這145例受試者均表現(xiàn)為Hb A2水平處于β-地貧篩查陽性界值,但MCV和MCH正常,進行KLF1突變基因分型后發(fā)現(xiàn),其中52例受試者攜帶KLF1突變,即在不存在β地貧突變的前提下,個體單獨攜帶KLF1突變也可導致Hb A2水平升高[28]。一項關于中國人群KLF1變異攜帶頻率的β地貧大樣本隊列研究,其中有16例攜帶KLF1突變的非地貧攜帶者Hb A2水平處于臨界高值,均值為(3.28±0.45)%,48例攜帶KLF1突變的β地貧患者隊列Hb A2水平升高,均值為(6.51±0.81)%[29-30]。另一項1 468例中國α-地貧人群KLF1變異攜帶頻率的研究表明,有72例伴KLF1突變的α-地貧個體,Hb A2水平較無KLF1突變攜帶的個體升高,均值為(3.3±0.40)%[30-31]。因此,建議對臨界升高的Hb A2病例,尤其是伴有Hb F升高的,進行KLF1測序,并將此作為地貧篩查計劃的一部分。

SUPT5H是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個可影響Hb A2水平的基因。來自荷蘭、希臘和法國的5個家系的26例SUPT5H變異攜帶者研究表明,SUPT5H變異攜帶者Hb A2范圍為4.7%～12.4%,SUPT5H變異攜帶者伴有Hb A2升高,但是MCV和MCH可表現(xiàn)為顯著降低,亦可表現(xiàn)為處于正常水平。這些特殊家系案例提示SUPT5H可作為一種潛在的δ-珠蛋白鏈調節(jié)基因的作用[32-33]。一項47 336例東莞地區(qū)受試者血液學表型與基因型關聯(lián)的研究中[34],有38例無HBB基因或KLF1變異伴Hb A2升高的可疑受試者,其中有7例攜帶SUPT5H變異,這一發(fā)現(xiàn)強調綜合分子診斷對預防地貧出生缺陷的重要性。另外,遺傳性球形紅細胞癥、巨成紅細胞性貧血和甲狀腺機能亢進等多種因素亦可影響Hb A2水平,干擾地貧篩查的結果,醫(yī)務人員進行地貧診斷時需予以鑒別排除[24]。

綜上所述,地貧篩查是預防地貧發(fā)生的關鍵,常用的血細胞分析和血紅蛋白電泳檢測操作簡便,易于推廣,針對不同的人群和不同地貧篩查的目的,應根據(jù)具體情況選擇不同的篩查策略,目前有大量的臨床研究致力于尋找適合區(qū)域特性的最佳篩查策略,試圖盡量減少地貧的遺漏或誤診。針對高發(fā)地區(qū)應加強地貧篩查的力度和推動產(chǎn)前診斷技術的發(fā)展,進而從根本上減少重型地貧患兒的出生。本文通過歸納總結地貧篩查指標的臨床情況,希望能使同道們更全面地了解地貧篩查并對各項篩查參數(shù)有更深的理解,從而更好地指導臨床診斷和提供遺傳咨詢。

利益相關聲明:論文內容不涉及相關利益沖突,該研究未涉及任何廠家及相關雇主或其他經(jīng)濟組織直接或間接的經(jīng)濟或利益的贊助。

作者貢獻說明:商璇負責組織起草論文框架,提供寫作思路和參考文獻,并對論文內容進行審閱及修訂;王星敏負責文獻查閱和整理,論文撰寫。