鮑新坤,張曉雨,肖文潔,孫光軍,林愛珍

(湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430061)

肛瘺又名肛門直腸瘺,多為肛門直腸周圍間隙膿腫破潰或引流后形成,是結直腸肛門外科領域中常見的疾病之一[1]。本病易反復發(fā)作,主要以手術治療為主。目前,肛瘺術后創(chuàng)面愈合時間長,排便和換藥時的劇烈疼痛,遠期瘢痕形成導致的肛門狹窄和失禁等成為困擾醫(yī)患雙方的重大問題,如何有效促進肛瘺術后創(chuàng)面愈合、縮短創(chuàng)面的愈合時間是臨床醫(yī)生亟須攻克的難題之一。近年來,腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子的異常表達在創(chuàng)面修復中的影響受到廣泛關注[2]。有研究表明,濕潤燒傷膏可通過激活轉化生長因子β1/Smad家族成員3信號通路,有效抑制白細胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達,從而促進燒傷創(chuàng)面愈合[3]。譚偉能[4]和汪明[5]報道,濕潤燒傷膏用于肛瘺術后換藥,可明顯減輕患者術后疼痛,減少術后瘢痕形成,縮短創(chuàng)面愈合時間,但具體分子機制尚未明確。本研究通過動態(tài)監(jiān)測肛瘺術后大鼠創(chuàng)面組織愈合情況及創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量,探討了濕潤燒傷膏促進創(chuàng)面愈合的作用機制,以為臨床應用濕潤燒傷膏促進肛瘺術后創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 30只SPF級SD雄性大鼠,6～8周齡,體重(200±20)g,由湖北省疾病預防控制中心動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗中心,飼養(yǎng)的環(huán)境符合國標(GB14925-2010)SPF級實驗動物所需的標準,室溫控制在22～24 ℃,相對濕度40%～60%,每日定時更換飼料,自由攝食飲水。

1.2藥物及菌株 濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司,規(guī)格:60 g/支),易孚[重組人表皮生長因子凝膠(酵母),桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司,規(guī)格:20 g/支],生理鹽水(湖南科倫制藥有限公司,規(guī)格:500 mL/瓶),金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液(湖北中醫(yī)藥大學腸道微生態(tài)實驗室提供)。

1.3主要試劑與儀器 伊紅Y(國藥集團,71014544);中性樹膠(國藥集團,10004160);蘇木素(Sigma,H9627);TNF-α(ABclonal,A11534);IL-1β(三鷹,21865-1-AP);離心機(H1650-W,湘儀);電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450,日本ASONE);FlexStation 3多功能酶標儀(Flexstation3,Molecular Devices)。

1.4實驗方法 所有大鼠均先進行適應性喂養(yǎng)7 d,然后按照隨機數(shù)字表法分為濕潤燒傷膏組、易孚組及生理鹽水組,每組10只。3組均參考文獻[6]方法建立肛瘺術后創(chuàng)面:對手術區(qū)域進行備皮,用5%水合氯醛溶液(0.007 mL/g)腹腔注射麻醉大鼠后,用碘伏消毒手術區(qū)域,剪除邊長約為3.0 cm的方形皮膚,創(chuàng)面深至肌層。傷口淋灑金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液,創(chuàng)面部位敷以創(chuàng)面相應大小的油紗敷料,用紗布包扎止血,24 h后去除紗布和敷料。每日傷口淋灑金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液0.2 mL,72 h后見傷口有膿性分泌物,滲液較多,創(chuàng)緣皮色發(fā)紅,類似于臨床肛瘺術后“急性、開放、滲血、感染”的創(chuàng)面,提示造模成功。造模成功后,每日下午定時對3組大鼠創(chuàng)面進行換藥1次,換藥時濕潤燒傷膏組創(chuàng)面外敷濕潤燒傷膏0.2 mL,易孚組創(chuàng)面外敷易孚凝膠0.2 mL,生理鹽水組創(chuàng)面外敷生理鹽水0.2 mL。

1.5觀察指標及方法

1.5.1創(chuàng)面愈合情況 分別于換藥第3,7,14天,肉眼觀察創(chuàng)面顏色、肉芽生長、分泌物滲出、結痂等情況,并拍照記錄創(chuàng)面愈合情況。每組大鼠各隨機選取3只(共9個創(chuàng)面),用透明薄膜緊密敷貼于創(chuàng)面上,用較細記號筆畫出傷口的邊緣,然后將透明薄膜平鋪在ECG紙上,計算出創(chuàng)面面積,創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2創(chuàng)面組織病理學形態(tài) 換藥第14天麻醉所有大鼠,在無菌條件下取創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生肉芽組織,洗去表面血液后固定于10%中性福爾馬林溶液中。將提取的新生肉芽組織經過脫水、透明、石蠟包埋制成蠟塊,用病理切片機進行切片,切好的組織片放入40 ℃的水浴鍋中進行攤片,切片用二甲苯脫蠟、蘇木精-伊紅染色5 min、自來水浸洗30 s、乙醇梯度脫水,風干后中性樹膠封片,最后顯微鏡(×100)下觀察創(chuàng)面組織的病理學形態(tài)。

1.5.3創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量 換藥第14天,提取并準確稱取創(chuàng)面組織30 mg,加入800 μL預冷PBS沖洗組織表面血液。將洗凈后的組織放入600 μL預冷PBS勻漿機勻漿至無明顯組織顆粒,低溫離心后取上清。將上清放入-40 ℃冰箱凍融,此過程重復2次。按BCA定量方法進行蛋白定量至統(tǒng)一濃度。嚴格按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β含量,用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析。

2 結 果

2.13組大鼠創(chuàng)面愈合情況 換藥第3天,生理鹽水組大鼠創(chuàng)面局部可見少許分泌物,顏色相對黑暗;易孚組大鼠創(chuàng)面邊緣可見少許肉芽組織增生;濕潤燒傷膏組大鼠局部可見皮紋增生,表面少許痂皮覆蓋,局部組織較干燥。換藥第7天,濕潤燒傷膏組創(chuàng)面修復面積均明顯大于生理鹽水組與易孚組。換藥第14天,3組大鼠創(chuàng)面局部邊緣均可見毛發(fā)覆蓋,易孚組局部少許滲出,濕潤燒傷膏組局部組織干燥,且濕潤燒傷膏組創(chuàng)面明顯小于生理鹽水組與易孚組。見圖1。

圖1 3組肛瘺術后創(chuàng)面模型大鼠換藥第3,7,14天肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況

2.23組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 換藥第3天,3組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);換藥第7天和第14天,濕潤燒傷膏組和易孚組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯高于同期生理鹽水組(P均<0.05),且濕潤燒傷膏組均明顯高于同期易孚組(P均<0.05)。見表1。

表1 3組肛瘺術后創(chuàng)面模型大鼠換藥后不同時間點創(chuàng)面愈合率比較

2.33組大鼠創(chuàng)面組織病理形態(tài)比較 換藥第14天,生理鹽水組大鼠創(chuàng)面組織出現(xiàn)大量炎癥細胞聚集、浸潤,少量纖維和膠原蛋白沉積,創(chuàng)面形成肉芽組織;易孚組大鼠創(chuàng)面組織炎性細胞較生理鹽水組明顯減少,局部可見紅細胞溢出血管壁外,大量膠原蛋白沉積,肉芽組織增多;濕潤燒傷膏組大鼠創(chuàng)面組織炎性細胞較易孚組明顯減少,膠原組織清晰可見并排列整齊,創(chuàng)面肉芽組織生長明顯。見圖2。

圖2 3組肛瘺術后創(chuàng)面模型大鼠換藥第14天創(chuàng)面組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.43組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量比較 換藥第14天,濕潤燒傷膏組和易孚組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05),且濕潤燒傷膏組TNF-α、IL-1β含量均明顯低于易孚組(P均<0.05)。見表2。

表2 3組肛瘺術后創(chuàng)面模型大鼠換藥第14天創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量比較

3 討 論

由于肛門排便的特殊性,肛瘺易慢性遷延難愈,多需要手術治療。目前大多數(shù)肛瘺手術采取開放性切開引流,術后創(chuàng)面疼痛、感染和愈合速度等與術后換藥關系密切[7],若傷口愈合不良可增加再次手術的風險,嚴重影響患者身心健康?，F(xiàn)代醫(yī)學認為,創(chuàng)面修復主要包括炎癥反應、肉芽增殖、組織重塑3個階段,其中創(chuàng)面炎癥水腫、血管生成以及上皮化異常、肉芽組織過度增生等是影響創(chuàng)面愈合過程中的主要因素,因此維持一個良好的傷口環(huán)境及狀態(tài)在創(chuàng)面修復中至關重要[8]。

中醫(yī)學認為,肛瘺手術時肛周組織同時為金刃所傷,形成潰瘍創(chuàng)面,余邪未盡,氣滯血瘀,兩邪客留經絡,經絡受阻,氣血不暢,致潰瘍面失于榮養(yǎng),膿腐難祛,新肉難生,病程遷延不愈。治療上宜采用祛邪、化瘀、補虛等手段調和氣血,從而促進潰瘍面修復[9-10]。濕潤燒傷膏是由黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼等藥材制成的中藥膏,外用于創(chuàng)傷、潰瘍久不收口具有較好的治療效果。相關研究報道,濕潤燒傷膏外用可給創(chuàng)面提供充分的氧供和營養(yǎng)物質,刺激創(chuàng)面新生肉芽組織中大量的血管生成,機制可能與調控抵抗素樣分子α(RELM-α)表達、活化PI3K/Akt/eNOS信號通路有關[11-12]。本實驗結果顯示,濕潤燒傷膏組大鼠換藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均明顯高于生理鹽水組和易孚組,病理觀察顯示創(chuàng)面組織炎性細胞明顯減少,大量膠原蛋白沉積,表明濕潤燒傷膏可以有效促進大鼠肛瘺術后創(chuàng)面模型的愈合。

術后創(chuàng)面修復是一個復雜、多步驟的過程,其中炎癥反應的程度是影響創(chuàng)面愈合速度的主要因素[13-14]。機體各類炎癥反應與炎癥因子的參與密切相關,在免疫應答的急性期主要由TNF-α、IL-6和IL-1β等因子介導,這也是研究中醫(yī)藥治療干預各種感染性炎癥所涉及的常見效應靶點[15]。TNF-α是主要由活化的單核巨噬細胞產生的一種多功能Th1細胞因子[16],當機體受到損傷和刺激后會迅速釋放TNF-α,激發(fā)宿主防御機制,并趨化其他免疫細胞清除創(chuàng)面感染[17-18]。IL-1β由多種細胞合成并分泌,早期可介導機體免疫反應,參與局部抗炎并吞噬及清除壞死組織[19]。既往研究表明,中藥治療能參與巨噬細胞介導的炎癥反應,調節(jié)機體抗感染能力,抑制炎癥損傷,促進受損組織的修復和血管生成,從而促進創(chuàng)面愈合[20-21]。本實驗結果顯示,濕潤燒傷膏組換藥第14天創(chuàng)面組織內TNF-α、IL-1β含量明顯低于生理鹽水組及易孚組,提示濕潤燒傷膏可以通過降低TNF-α、IL-1β含量,減輕大鼠局部創(chuàng)面的炎癥反應程度,促進創(chuàng)面愈合。

綜上所述,濕潤燒傷膏可以加快肛瘺術后模型大鼠創(chuàng)面組織修復過程,機制可能與降低創(chuàng)面內TNF-α、IL-1β的含量,抑制炎癥反應有關。本實驗結果為濕潤燒傷膏臨床用于肛瘺術后創(chuàng)面治療提供了一定理論依據(jù),但創(chuàng)面的修復過程涉及的機制復雜,該藥是否可通過其他靶點發(fā)揮作用有待進一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。