李翰星,弓 鵬,龐 越,魏向東,門九章

(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西 晉中 030619)

功能性消化不良( functional dyspepsia,FD)也稱為非潰瘍性消化不良,是最常見(jiàn)的功能性胃腸道疾病之一。FD通常表現(xiàn)為上腹部疼痛、持續(xù)和反復(fù)出現(xiàn)的上腹脹、早飽、厭食、惡心和腹部不適等[1]。FD 的危險(xiǎn)因素包括胃腸道感染、腹瀉、胃排空和胃調(diào)節(jié)受損、十二指腸炎癥、黏膜通透性改變、使用抗生素或抗炎藥、早期環(huán)境微生物暴露、吸煙、肥胖、社會(huì)心理因素等[2-3]。目前針對(duì)FD尚無(wú)特效治療方法,主要是給予飲食調(diào)整、藥物治療和心理治療,與調(diào)整飲食和心理治療相比,藥物治療起效更快,但對(duì)癥狀的改善作用也有限,且不宜長(zhǎng)期應(yīng)用[4-6]。因此,尋找新的有效藥物治療FD至關(guān)重要。中醫(yī)藥用于功能性胃腸道疾病的治療歷史悠久[7],其中出自《小兒藥證直訣》的異功散具有行氣化滯、醒脾助運(yùn)作用,且補(bǔ)而不滯,主治脾胃氣虛兼氣滯諸證[8]。杜曉泉教授認(rèn)為FD的基本病機(jī)是脾失健運(yùn)、胃氣壅滯,病位在脾胃,與肝相關(guān),病理因素以食滯、氣滯、濕阻最常見(jiàn),用藥以異功散合香蘇散為基本方,療效顯著[9]。但異功散治療FD的機(jī)制尚不明確,故本研究通過(guò)建立FD大鼠模型,探討了異功散對(duì)FD癥狀的緩解作用及可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,5～6周齡,體重180～220 g,由山西醫(yī)科大學(xué)迎澤校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(晉)2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(晉)2020-0006,保持溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度(55±2)%,進(jìn)行12 h的光暗循環(huán),持續(xù)7 d。本研究獲山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022017)。

1.2主要藥物、試劑和儀器 異功散按《小兒藥證直訣》所載原方比例:人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、陳皮各6 g,中藥均由山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供,制成水煎劑,并配成含生藥約1 g/mL的溶液,充分?jǐn)噭?貯于4 ℃冰箱備用。多潘立酮(西安楊森制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H10910003)。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、二辛寧可酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;大鼠胃動(dòng)素(MTL)、大鼠胃泌素(GAS)、大鼠血管活性腸肽(VIP)和大鼠降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)ELISA試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白1(ZO-1)、連接黏附分子1(JAM-1)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的山羊抗兔IgG均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。BH-2光學(xué)顯微鏡(日本東京奧林巴斯);凝膠成像儀、680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、多潘立酮組、異功散低劑量組、異功散中劑量組和異功散高劑量組,每組10只。對(duì)照組大鼠正常喂養(yǎng),其余5組大鼠采用不規(guī)則喂食夾尾刺激法[10]建立FD模型。具體方法:單日喂養(yǎng),雙日禁食。在禁食日,用長(zhǎng)海綿鉗夾住大鼠尾部1/3的末端,讓它們尖叫和掙扎(不損傷皮膚);刺激它們,讓它們生氣,并讓它們與籠子里的其他大鼠打架(任何在打架中被抓傷的大鼠都用碘酒處理以防止感染)。刺激時(shí)間為10 min/次,間隔1 h后重復(fù)刺激,4 h后停止。14 d后結(jié)束造模,大鼠恢復(fù)正常喂養(yǎng)。多潘立酮組給予多潘立酮3.5 mg/(kg·d)灌胃,異功散低、中、高劑量組分別給予3 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、12 g/(kg·d)的異功散灌胃,對(duì)照組和模型組給予生理鹽水10 mL/kg灌胃,均1次/d,持續(xù)14 d。在整個(gè)研究過(guò)程中,所有大鼠均自由飲水。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1大鼠一般情況及體重、攝食量 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠的外觀、行為、腺體分泌和呼吸等情況,記錄每只大鼠的每日食物攝入量和每周體重,計(jì)算體重增量和平均食物攝入量。

1.4.2胃排空率、小腸推進(jìn)率 末次灌胃后,大鼠禁食24 h,每組隨機(jī)取6只大鼠,給予5%的石墨粉與牛奶和葡萄糖水糊劑灌服(稱重并記錄為A1),30 min后麻醉處死。取出胃和小腸,觀察胃、胃十二指腸和回腸連接處結(jié)扎后腸道內(nèi)石墨粉的前緣,測(cè)量從幽門到回盲部的小腸長(zhǎng)度和石墨粉的推進(jìn)長(zhǎng)度。計(jì)算腸道推進(jìn)率:腸道推進(jìn)率=石墨粉的長(zhǎng)度/小腸的全長(zhǎng)×100%。切取胃部,稱重(記錄為A2)后并將其浸入生理鹽水中以清洗剩余的石墨粉,用吸水紙擦干以去除表面水分后,再次對(duì)胃進(jìn)行稱重(記錄為A3),計(jì)算胃排空率:胃排空率=(A2- A3)/A1。

1.4.3胃竇組織HE染色病理形態(tài) 取各組大鼠的胃竇組織,固定在4%多聚甲醛溶液中48 h后脫水,石蠟包埋,制備4 μm組織切片,切片脫蠟后,蘇木素染色2 min,流水沖洗5 min,伊紅染色90 s,流水沖洗10 min,60 ℃烤箱烤片30 min,中性樹(shù)脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.4血清腦腸肽指標(biāo)水平 取每組剩余的4只大鼠,麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,分離血清并-80 ℃保存。使用ELISA試劑盒測(cè)定血清MTL、GAS、VIP和CGRP水平。

1.4.5十二指腸黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)情況用RIPA裂解液裂解大鼠十二指腸組織,在4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清液,采用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解產(chǎn)物,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉膜2 h,然后與一抗閉合蛋白(1∶1 000)、ZO-1(1∶1 000)、JAM-1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜,洗膜后加入HRP耦聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000)在室溫下孵育1 h。隨后,使用ECL對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影,然后在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照。使用β-actin為內(nèi)參,采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 對(duì)照組大鼠的外觀、行為、呼吸等均正常;模型組大鼠出現(xiàn)脾氣暴躁、經(jīng)常扭打、四肢和頭部抓撓等異常癥狀,且活動(dòng)減少,無(wú)精打采,毛發(fā)無(wú)光,反應(yīng)遲鈍,糞便稀薄;多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠灌胃14 d后活動(dòng)量增加,毛發(fā)潤(rùn)澤度和反應(yīng)力有所恢復(fù),糞便正常;異功散低劑量組大鼠狀態(tài)與模型組大鼠相似。

2.2各組大鼠體重和食物攝入量比較 模型組大鼠的體重增量和食物攝入量均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠的體重增量和食物攝入量均明顯高于模型組和異功散低劑量組(P均<0.05),異功散低劑量組大鼠的體重增量和食物攝入量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);多潘立酮組和異功散高劑量組大鼠的體重增量和食物攝入量均明顯高于異功散中劑量組(P均<0.05),多潘立酮組和異功散高劑量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和功能性消化不良各組大鼠體重和食物攝入量比較

2.3各組大鼠胃排空率和腸道推進(jìn)率比較 模型組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率均明顯高于模型組和異功散低劑量組(P均<0.05),異功散低劑量組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);多潘立酮組和異功散高劑量組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率均明顯高于異功散中劑量組(P均<0.05),多潘立酮組和異功散高劑量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組和功能性消化不良各組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率比較

2.4各組大鼠胃竇病理組織形態(tài)比較 對(duì)照組大鼠胃竇組織形態(tài)正常,黏膜光滑,黏膜層和肌層清晰;模型組大鼠胃竇黏膜層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),胃黏膜變薄、破裂;多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠胃竇黏膜層僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)明顯其他病理?yè)p傷;異功散低劑量組病理形態(tài)較模型組未見(jiàn)明顯改善。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和功能性消化不良各組大鼠胃竇組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠血清腦腸肽水平比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠的血清MTL和GAS水平均明顯降低(P均<0.05),血清VIP和CGRP水平均明顯升高(P均<0.05)。異功散低劑量組大鼠血清MTL、GAS、VIP和CGRP水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠血清MTL和GAS水平均明顯高于模型組和異功散低劑量組(P均<0.05),血清VIP和CGRP水平均明顯低于模型組和異功散低劑量組(P均<0.05)。與異功散中劑量組比較,多潘立酮組和異功散高劑量組大鼠血清MTL和GAS水平均更高(P均<0.05),血清VIP和CGRP水平均更低(P均<0.05),多潘立酮組和異功散高劑量組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組和功能性消化不良各組大鼠血清腦腸肽水平比較

2.6各組大鼠十二指腸黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 模型組大鼠十二指腸組織中Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05);多潘立酮組和異功散中、高劑量組大鼠十二指腸組織中Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組和異功散低劑量組(P均<0.05),異功散低劑量組大鼠十二指腸組織中Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);多潘立酮組和異功散高劑量組大鼠十二指腸組織中Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于異功散中劑量組(P均<0.05),多潘立酮組和異功散高劑量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

A為對(duì)照組;B為模型組;C為多潘立酮組;D為異功散低劑量組;E為異功散中劑量組;F為異功散高劑量組圖2 對(duì)照組和功能性消化不良各組大鼠十二指腸組織中腸黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

目前治療FD的常用藥物包括抑酸藥、促動(dòng)力藥和抗幽門螺桿菌藥物[11]。多潘立酮是一種外周多巴胺受體阻滯劑,可增強(qiáng)胃運(yùn)動(dòng),促進(jìn)胃排空,并協(xié)調(diào)胃和十二指腸運(yùn)動(dòng)[12],故本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。異功散別名小兒異功散、五味異功散,其方藥組成是在《太平惠民和劑局方》中補(bǔ)脾的四君子湯(人參、白術(shù)、炙甘草、茯苓)中增加行氣化滯的陳皮,使參苓術(shù)草補(bǔ)而不膩,成為補(bǔ)運(yùn)兼施之方,產(chǎn)生“補(bǔ)脾而能流動(dòng)不滯”的功效,在臨床應(yīng)用中已顯示出改善FD癥狀的作用[13]。然而,異功散作用的潛在機(jī)制尚不清楚,故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)研究。由于食物攝入減少和體重下降是FD的臨床特征,因此在建立FD大鼠模型之前和之后測(cè)量并記錄大鼠的體重和食物攝入。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠體重增量和食物攝入量均明顯低于對(duì)照組,且大鼠精神狀態(tài)和生理行為表現(xiàn)異常,表明FD大鼠模型成功建立;異功散中、高劑量組大鼠的體重增量和食物攝入量均明顯高于模型組,精神狀態(tài)和生理行為也恢復(fù)正常,提示異功散可以改善FD癥狀。

胃排空是指通過(guò)胃和十二指腸的推動(dòng)作用將食物從胃排空到十二指腸的過(guò)程。大多數(shù)FD患者有胃腸道運(yùn)動(dòng)障礙,這與胃排空延遲有關(guān)[14]。腸道運(yùn)動(dòng)緩慢和胃排空障礙之間存在密切聯(lián)系[15]。此外,某些腸道激素如MTL、GAS、VIP、CGRP可能在FD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3]。MTL主要作用是促進(jìn)胃內(nèi)容物排空[16];GAS存在于胃竇和十二指腸,受中樞和外周神經(jīng)調(diào)節(jié),其可刺激胃酸分泌,能加快胃電節(jié)律,促進(jìn)胃排空[17];VIP廣泛分布于神經(jīng)組織和胃腸道,其可抑制胃腸道運(yùn)動(dòng),延遲胃排空,減慢小腸運(yùn)動(dòng)[18];CGRP廣泛分布于胃腸道神經(jīng)叢中,可抑制胃酸分泌,減慢胃腸運(yùn)動(dòng),調(diào)節(jié)胃腸道激素分泌[19]?；诖?本研究通過(guò)檢測(cè)胃排空率、小腸推進(jìn)率和上述4種胃腸激素水平來(lái)評(píng)估異功散對(duì)FD大鼠腸胃功能的影響。結(jié)果顯示,模型組大鼠存在明顯胃排空延遲和腸道運(yùn)動(dòng)緩慢,血清GAS和MTL水平明顯降低,血清VIP和CGRP水平明顯增高;與模型組比較,異功散中、高劑量組大鼠的胃排空延遲和腸道運(yùn)動(dòng)緩慢明顯改善,血清GAS和MTL水平均明顯升高,血清VIP和CGRP水平均明顯降低。提示異功散可能通過(guò)上調(diào)GAS和MTL水平、下調(diào)VIP和CGRP水平來(lái)改善FD大鼠胃腸運(yùn)動(dòng),用量在6～12 g/(kg·d)效果更好。

研究發(fā)現(xiàn)FD患者十二指腸內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量顯著減少,導(dǎo)致黏膜屏障功能受損,當(dāng)黏膜屏障發(fā)生功能障礙時(shí),病原體或過(guò)敏原會(huì)引起免疫反應(yīng),這些病原體或過(guò)敏原會(huì)穿過(guò)十二指腸的腸上皮;此外,這種局部反應(yīng)可能引發(fā)腸屏障損傷、腸外癥狀,甚至全身免疫反應(yīng)[3,20]。作為上皮機(jī)械屏障的重要組成部分,緊密連接相關(guān)蛋白如Occludin、ZO-1、JAM-1參與保護(hù)腸黏膜,維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠十二指腸組織中Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低,異功散中、高劑量組Occludin、ZO-1、JAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組。提示異功散可能通過(guò)上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)腸黏膜屏障。

綜上所述,異功散可以通過(guò)調(diào)節(jié)腦腸肽的分泌促進(jìn)FD大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng),可通過(guò)上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)腸黏膜屏障,為異功散治療FD提供了一定理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。