羅麗蓉,李宏洋,吳擁軍,李升

1(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽,550025)2(貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院,貴州 貴陽,550025)

我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡椒因含有豐富的有機酸,具有維持人類腸道菌群平衡、降低膽固醇、增強免疫力和抗氧化性等多種益生作用,深受人們的喜愛[1]。目前,工業(yè)生產(chǎn)泡椒大多還是依靠原料自身攜帶的菌群和環(huán)境微生物進行自然發(fā)酵。由于自然發(fā)酵過程參與的菌株種類復(fù)雜多樣,發(fā)酵過程難以控制,導(dǎo)致各批次的泡椒質(zhì)量與風(fēng)味不同,很難獲得穩(wěn)定的品質(zhì)[2]。因此,在發(fā)酵時人工接入具有發(fā)酵優(yōu)勢的益生菌株進行強化發(fā)酵,取代傳統(tǒng)的自然發(fā)酵,可以開發(fā)出質(zhì)量更穩(wěn)定的產(chǎn)品也更適宜于規(guī)?；?、標準化生產(chǎn),而具有發(fā)酵優(yōu)勢菌株的獲得則是實現(xiàn)強化發(fā)酵的前提條件。曾維友等[3]從泡菜中篩選出優(yōu)異乳酸菌株,但適合泡椒發(fā)酵的優(yōu)異乳酸菌卻鮮有報道。這是由于泡菜所組成的微生物菌群與泡椒的區(qū)別較大,泡菜中對微生物的生長起抑制作用的主要因素是高鹽環(huán)境,而泡椒中除了高鹽外還有由辣椒素所構(gòu)成的辣度體系會對相關(guān)微生物的生長產(chǎn)生抑制作用[4]。泡椒中分離的乳酸菌除了產(chǎn)酸耐鹽以外,推測其還具有一定程度的耐辣椒素或辣椒堿的特性。因此,從泡椒資源豐富的地區(qū)分離篩選出產(chǎn)酸強、耐鹽、耐辣椒素的發(fā)酵特性好的優(yōu)異菌株,對泡椒生產(chǎn)行業(yè)的具有重要理論和現(xiàn)實意義。

針對以上問題,本研究從四川農(nóng)家自制不同年份的泡椒老鹵水中分離乳酸菌,以總酸、耐辣椒素及耐鹽程度為指標,再結(jié)合發(fā)酵泡椒的理化特性,篩選出發(fā)酵性能優(yōu)異的乳酸菌。同時通過人工胃腸液、自聚性、抗生素敏感性以及抗氧化能力測試初步評價所篩的菌株益生性能,為后續(xù)應(yīng)用于泡椒強化發(fā)酵提供候選菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株分別來自于四川成都市金堂縣、成都青羊區(qū)、德陽廣漢市、綿陽市農(nóng)家自制泡椒鹵水,鹵水年限分別為1年、2年、5年和6年。商用專用泡菜發(fā)酵菌株短乳桿菌CICC6239,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;MRS肉湯培養(yǎng)基及瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胃蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;碳酸鈣、NaCl、HCl、1,10-菲啰啉,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;抗生素藥敏片,南京全隆生物技術(shù)有限公司;辣椒素,華天生物科技有限公司;DPPH和ABST試劑,福州飛凈生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平,上海梅特勒托利多科技(中國)有限公司;pH計、YJ-840超凈工作臺、UV-2100分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱,上海-精宏實驗設(shè)備有限公司;GR60DA高壓蒸汽滅菌鍋、賽默飛離心機,蘇州賽恩斯儀器有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵性能好乳酸菌的篩選

1.3.1.1 產(chǎn)酸能力

取1 mL泡椒老鹵水,按梯度稀釋取稀釋液0.1 mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約36 h。以融鈣圈及生理生化特性選出10株乳酸菌并活化,按體積比2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h后,以總酸作為篩選指標來初篩出產(chǎn)酸能力強的菌株。

1.3.1.2 耐辣椒素及耐鹽能力

將分離菌株的活菌數(shù)調(diào)整為1.0×108CFU/mL,取其菌懸液0.1 mL分別涂布至含辣椒素1.1、2.2、3.3、4.4 g/L的MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后計算活菌數(shù)。按2%的接種量分別接種至含NaCl 0、20、40、60、80、100 g/L的MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測定其發(fā)酵液的OD600 nm值。

1.3.2 泡椒理化指標

1.3.2.1 感官評價

將菌株活化2代并將活菌數(shù)稀釋至1.0×108CFU/mL,再按料液比的1%的接種量、8%食鹽、2%冰糖接種在預(yù)處理好的辣椒樣品中,室溫發(fā)酵15 d 后參考張楠笛等[5]的風(fēng)味評分標準來評價產(chǎn)品的色澤、酸度、脆度、形態(tài)、滋味、澀味和香氣。

1.3.2.2 總酸及亞硝酸鹽含量

總酸測定參考GB 12456—2021中的酸堿滴定法,將發(fā)酵15 d的泡椒液低溫離心取其上清液,參照GB 5009.33—2016中的方法,測定亞硝酸鹽含量。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定

將菌株活化培養(yǎng)18 h后,提取基因組DNA[6]。以27 F、1492 R為引物對菌株16S rDNA進行PCR擴增,PCR擴增體系(50 μL):上和下游引物各為2 μL、dNTPMix 4 μL、Taq酶0.5 μL,10×ExTaq Buffer 5 μL,模板DNA 2.5 μL,無菌ddH2O 34 μL。將PCR產(chǎn)物送上海生工進行測序,測序結(jié)果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性序列比對,選取并下載同源性大于99%的乳酸菌,然后使用MEGA 7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建親緣關(guān)系系統(tǒng)樹[7]。

1.3.4 益生特性

1.3.4.1 人工胃腸液的耐受性

參照陳明等[8]的方法并略作修改,菌株培養(yǎng)16 h后,4 ℃、4 500 r/min離心,用0.01 mol/L的PBS(pH值7.2)緩沖液洗滌菌體2次,然后用1 mL PBS重懸菌體并混于9 mL的模擬胃液中37 ℃孵育0 h和2 h后取出0.1 mL培養(yǎng)液涂布于MRS培養(yǎng)基,再取胃液處理2 h的培養(yǎng)液1 mL重懸于9 mL的模擬腸液中并在3 h和8 h分別取樣涂布MRS培養(yǎng)基計算活菌數(shù),存活率按公式(1)、公式(2)計算:

(1)

(2)

式中:N0為胃液中0 h的活菌數(shù);N1為胃液中2 h的活菌數(shù);N2分別為腸液中3 h或8 h的活菌數(shù),CFU/mL。

1.3.4.2 自聚性

自聚率參考楊振泉等[9]的方法并作修改,取調(diào)整濃度的菌懸液4 mL置于試管中室溫靜置分層,分別在靜置1、3、5 h時吸取1 mL上層溶液測OD600nm值,分別記作OD1、OD3和OD5,每組重復(fù)3次。自聚率按公式(3)計算:

(3)

式中:ODo和ODt分別代表自凝聚前、后上層懸液的OD600nm值。

1.3.4.3 抗生素敏感性

采用K-藥敏紙片瓊脂擴散法[10]測定菌株對6種不同抗生素的藥敏性。將活菌數(shù)稀釋至1×108CFU/mL,取0.1 mL涂布于MRS培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑,根據(jù)韓慧玲等[11]的判定標準來測定并將結(jié)果以抗性(R)、中性(I)和敏感(S)表示。

1.3.4.4 抗氧化活性

按照參考文獻[12]中的方法測定DPPH自由基清除率及參考文獻[13]中的方法測定羥自由基清除率及參考文獻[14]測定ABST陽離子自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

本試驗數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的平均值±標準差表示,數(shù)據(jù)Excel軟件進行整理和分析,用SPSS 21進行顯著性分析,使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選

2.1.1 產(chǎn)酸能力初篩

以泡菜專用發(fā)酵的商用菌株(CICC 6239)為標準,根據(jù)融鈣圈、生理生化特性以及24 h后的總酸含量,本研究分別從4罐不同年份的泡椒老鹵水中初分離出7株總酸含量高于商用菌株6239的產(chǎn)酸菌株,并將這些菌株作進一步研究。

2.1.2 耐辣椒素及耐鹽復(fù)篩

將初篩出的7株菌進行不同辣椒素質(zhì)量濃度耐受實驗和耐鹽實驗。隨著辣椒素質(zhì)量濃度和鹽質(zhì)量濃度的增加,各菌株的存活率逐漸降低,其中1Y-17、1Y-35、1Y-42、6Y-15、6Y-23在4.4 g/L辣椒素濃度下活菌數(shù)均大于1×108CFU/mL(表1),當NaCl質(zhì)量濃度為80 g/L時,只有1Y-17、1Y-35和6Y-15仍具有生長能力,其中1Y-35的耐辣椒素和耐鹽能力最強。

表1 分離菌株在不同質(zhì)量濃度辣椒素下的活菌數(shù) 單位:lgCFU/mL

2.1.3 泡椒的理化指標

2.1.3.1 感官評價

將以上篩出的3株乳酸菌和商用菌株6239進行泡椒發(fā)酵并做自然發(fā)酵對照,樣品及感官評價圖分別如圖1和圖2所示,3株自篩菌強化發(fā)酵泡椒的感官評價得分均高于商用菌株和自然發(fā)酵組,其中6Y-15整體評分最高,為51.5分,自然發(fā)酵組色澤氧化程度高于菌株強化發(fā)酵組。

a-自然發(fā)酵;b-6239;c-1Y-17;d-1Y-35;e-6Y-15圖1 不同菌株發(fā)酵泡椒的樣品圖Fig.1 Sample diagram of fermented pickled chilli with different strains注:6239商用菌株(下同)。

圖2 泡椒發(fā)酵感官風(fēng)味評價Fig.2 Evaluation of sensory flavor of pickled chilli fermentation

2.1.3.2 總酸及亞硝酸鹽含量

3株自篩菌、1株商用菌和自然發(fā)酵泡椒發(fā)酵15 d后的總酸及亞硝酸鹽含量如圖3所示,3株自篩菌發(fā)酵泡椒后總酸含量均高于商用菌株[(7.13±0.25) g/kg]和自然發(fā)酵組[(6.05±0.15) g/kg],其中1Y-17總酸含量最高,為[(9.07±0.17) g/kg]。菌株1Y-17、1Y-35和6Y-15強化發(fā)酵泡椒15 d后的亞硝酸含量均顯著低于自然發(fā)酵[(4.18±0.25) mg/kg]和商用菌株發(fā)酵組[(2.82±0.15) mg/kg](P<0.05),分別為(2.21±0.15)、(1.76±0.24)、(2.06±0.20) mg/kg。

圖3 不同處理組泡椒總酸及亞硝酸含量Fig.3 Total acid and nitrite content of pickled chilli in different treatment groups注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

對篩選出的3株菌進行菌落和菌體觀察,3株菌的菌落均為白色圓形,單個、成對或成短鏈排列,其中菌株1Y-17菌落較大且表面黏稠;3株菌革蘭氏染色均為陽性;電鏡圖顯示3株菌的菌體均呈短桿狀,其中6Y-15菌體表面相對粗糙(圖4)。

a-菌落形態(tài);b-光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài);c-掃描電子顯微鏡下細胞形態(tài)圖4 菌株形態(tài)學(xué)特征Fig.4 Morphologyical characteristic of strains

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對3株菌進行16S rDNA 擴增測序并與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列構(gòu)建親緣關(guān)系樹后(圖5),發(fā)現(xiàn)菌株1Y-17、1Y-35、6Y-15與LactobacillusplantarumNBRC 1589屬于同一分支,從16S rDNA序列比對結(jié)果表明這3株菌均屬于植物乳桿菌。

圖5 分離菌株與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic trees of isolated strains and other related species

2.3 益生性能評價

2.3.1 人工胃腸液耐受性

3株菌經(jīng)過模擬胃液2 h處理后,所有菌株的活菌數(shù)均保持在1×108CFU/mL以上,存活率在96%以上。經(jīng)模擬胃液處理再轉(zhuǎn)運至模擬腸液中8 h后,3株菌的活菌數(shù)均大于4×106CFU/mL,說明這3株菌具有一定的人工胃腸液耐受性。

2.3.2 自聚性

通過測定3株菌株的自凝聚率反映其在腸道黏附和定植能力。在放置5 h時,菌株6Y-15的自凝聚率最高,達到51.58%,其次為1Y-17,為49.14%,1Y-35最低,僅為33.54%。

2.3.3 抗生素藥敏性

通過對抗生素的敏感性評估菌株是否具有安全性。由圖6可知,3株自篩菌對6種抗生素均敏感,其中1Y-35對紅霉素最敏感,抑菌圈為(29.75±0.43) mm,6Y-15對氨芐西林最敏感,抑菌圈為(29±0.71) mm,3株菌對四環(huán)素的敏感性均較弱。

CFZ-頭孢唑林;E-紅霉素;P-青霉素;C-氯霉素;AMP-氨芐西林;TE-四環(huán)素圖6 菌株對不同抗生素敏感性試驗Fig.6 Susceptibility test of bacterial strains to different antibiotics

2.3.4 體外抗氧化活性

通過測定自由基清除率評估3株菌的抗氧化能力。由表2可知,菌株6Y-15的DPPH自由基清除率和羥自由基清除率最高,分別為42.69%和65.78%,而1Y-17對ABST陽離子自由基清除率最高,為69.72%(P<0.05)。

表2 不同菌株發(fā)酵液的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of fermentation broth from different strains

3 結(jié)論與討論

本研究從四川不同地區(qū)農(nóng)家自制泡椒老鹵水中分離篩選出產(chǎn)酸強、耐辣椒素及耐鹽強的3株植物乳桿菌,將這3株菌用作強化發(fā)酵制作泡椒后,相比于自然發(fā)酵和商業(yè)菌株發(fā)酵,色澤及口感更好,總酸產(chǎn)量高,亞硝酸鹽含量低。分離的3株菌還具有一定的耐人工胃腸液能力、自聚性且對多種抗生素敏感,其中菌株6Y-15的DPPH自由基和羥自由基清除能力顯著,而菌株1Y-17的ABST陽離子自由基清除能力強。研究結(jié)果表明分離的3株植物乳桿菌可作為泡椒強化發(fā)酵的候選菌株。

已有研究顯示泡椒、泡菜、酸菜均是以乳酸菌為主導(dǎo)發(fā)酵而成,在發(fā)酵時人工添加具有優(yōu)異發(fā)酵特性的乳酸菌進行強化發(fā)酵取代自然發(fā)酵,可以使發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,更易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)中品質(zhì)把控[15-16]?？紤]到年代久遠的泡椒液中菌群更穩(wěn)定,更有代表性,所以本研究選擇從民間泡椒老鹵水中進行菌株的分離。老鹵水由于被反復(fù)使用,一般辣度和含鹽量均較高,有研究發(fā)現(xiàn)辣椒素和食鹽對乳酸菌的生長有明顯抑制作用[17]。本研究分離出的3株乳桿菌不僅產(chǎn)酸水平高且具有一定耐辣椒素和耐鹽特性,表明分離的菌株中存在一定的抗逆機制來適應(yīng)辣度和高鹽度體系。汪姣玲等[18]報道稱以多葉、多莖蔬菜為主要原料的泡菜中產(chǎn)酸快的主要是腸膜明串珠菌,而本研究篩選到的3株優(yōu)勢菌均為植物乳桿菌,推測可能是因為腸膜明串珠菌相對植物乳桿菌對辣椒素不耐受,所以泡椒中產(chǎn)酸強的乳酸菌以植物乳桿菌為主[19]。研究結(jié)果提示以純辣椒為主要原料發(fā)酵的泡椒,其菌群存在一定的特異性,在泡椒工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)合理運用。對篩選出的菌株進行小試發(fā)酵泡椒后,風(fēng)味優(yōu)于商用菌株發(fā)酵組和自然發(fā)酵組,吳凱等[20]研究發(fā)現(xiàn)高鹽濃度腌漬的辣椒揮發(fā)性成分較多且香氣成分高,因此推測在高辣高鹽環(huán)境中相關(guān)微生物代謝活動更為活躍,產(chǎn)生的有機酸種類和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更多,帶來的口感和滋味更豐富。

本研究篩選到的3株乳桿菌均顯示出一定的益生特性,如對人工胃腸液的耐受性、自聚性、藥敏性及抗氧活性。DI CAGNO等[21]報道了從菠蘿中篩選出的乳酸菌應(yīng)用于菠蘿發(fā)酵后,與同屬外來菌株相比,抗氧化活性最高;張婷等[22]研究發(fā)現(xiàn),辣椒中的辣椒素質(zhì)量濃度與其抗氧化活性呈正相關(guān),本研究篩到的菌株6Y-15的抗氧活性比楊旭洲等[23]篩選出的最高抗氧活性菌株Z12高出1.24%,這表明從泡椒鹵水中篩選出的乳酸菌株在辣椒刺激下具有較高的抗氧活性,結(jié)論可以為進一步研究發(fā)酵泡椒中的辣椒素與乳酸菌的生化代謝關(guān)系提供更多科學(xué)依據(jù)。綜上所述,菌株1Y-17、1Y-35和6Y-15的發(fā)酵性能優(yōu)良對高辣度高鹽環(huán)境具有一定適應(yīng)性,可作為工業(yè)生產(chǎn)泡椒時進行強化發(fā)酵的候選菌株,具有廣闊的應(yīng)用前景。