王艦,黃鈞浩,葉幫偉,許韓山,孫培龍,楊開*

1(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014) 2(中國輕工業(yè)食品大分子資源加工技術重點實驗室(浙江工業(yè)大學),浙江 杭州,310014) 3(浙江慧和健康科技有限公司,浙江 麗水,323000)4(杭州市臨平區(qū)質量計量監(jiān)測中心,浙江 杭州,311199)

猴頭菌(Hericiumerinaceus),又稱猴頭菇、獅子鬃毛,是常見的珍稀食藥用菌之一,屬于齒菌科擔子菌、猴頭菇屬真菌的一種。目前,已從猴頭菌子實體、菌絲體及發(fā)酵液中分離出多糖、蛋白質、萜類、甾醇、酚類等多種營養(yǎng)及功能活性物質。前期研究發(fā)現(xiàn),猴頭菌具有增強人體免疫[1]、抗腫瘤[2]、抗疲勞[3]、抑菌[4]、保護胃損傷和治療慢性萎縮性胃炎[5]、調節(jié)腸道菌群[6]、保護神經細胞[7-8]等諸多功效。除此之外,最新的研究表明猴頭菌還具有改善學習記憶能力[9]、防治阿爾茨海默癥[10]、改善骨關節(jié)炎癥[11]以及改善衰老過程中運動能力[12]的潛力。

野生猴頭菌資源有限,常用人工栽培方式培育子實體。但因人工栽培周期長,且受到環(huán)境因素制約,易受農藥、重金屬和塑化劑等殘留影響,不適合現(xiàn)代化工廠發(fā)展。液態(tài)發(fā)酵法能在短時間內獲得大量菌絲體及發(fā)酵液,且工藝設備較簡單,生產過程產品品質便于控制,已成為一種重要的食藥用菌生產途徑。在過去幾十年中,已經有幾十種食藥用菌采用液態(tài)發(fā)酵技術生產成功,其中大多數屬于擔子菌門及子囊菌門[13]。早期液態(tài)發(fā)酵研究中,提高發(fā)酵效率的主要方式是優(yōu)化培養(yǎng)工藝。隨著誘變育種技術的發(fā)展,已有多種誘變育種技術應用于猴頭菌的菌株變異與篩選,顯著提高了菌株活性與代謝產物生產能力。最近十幾年來,誘導調控技術成為了液態(tài)發(fā)酵中新的研究熱點,誘導調控是采用低劑量誘導劑以促進目標代謝物快速生物合成的一種發(fā)酵策略,具有經濟效益高,特異性強,工藝流程簡單,不易對環(huán)境造成污染等優(yōu)點[14]。

眾多研究結果表明猴頭菌液態(tài)發(fā)酵菌絲體及其發(fā)酵液具有很高的食藥用價值。此前關于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵領域的綜述性文章多針對于發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化以及發(fā)酵產品應用等方面,近十年來缺乏針對猴頭菌活性物質發(fā)酵方面的綜述。本文對猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產活性物質的最新進展進行綜述,歸納猴頭菌液態(tài)發(fā)酵相關生產工藝和技術,為進一步研究和利用猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產活性物質提供參考。

1 猴頭菌菌株誘變育種

選取生長力旺盛、代謝合成能力強的菌株是實行猴頭菌液態(tài)發(fā)酵的第一步,也是最關鍵的一步。目前,優(yōu)良菌株的選育一般是通過從野生猴頭菌中分離并篩選出生長力強的菌株進行純化、傳代。另一種途徑是通過誘變育種的方式,猴頭菌的誘變育種主要通過外源物理干擾,誘導猴頭菌菌株產生突變或調控基因表達,通過穩(wěn)定傳代篩選出生長旺盛,分泌代謝產物能力強的變異菌株。常用的方法有紫外線誘變、射線輻照誘變、超聲波誘變、離子束誘變等。如表1所示,研究人員利用篩選后的誘變菌株進行液態(tài)發(fā)酵,與原始菌株相比,誘變菌株在液態(tài)發(fā)酵過程中的生長速率以及代謝產物產量均明顯提高。

表1 不同誘變育種技術對猴頭菌液態(tài)發(fā)酵影響Table 1 Effects of different mutagenesis breeding techniques on liquid fermentation of Hericium erinaceus

1.1 紫外線誘變

紫外線誘變育種成本低、易操作且突變效果好,可在短時間內大量獲得突變體。菌株吸收紫外光后,DNA分子會形成嘧啶二聚體,引發(fā)DNA空間構象的改變,阻礙堿基間正常配對,從而引起誘變[22]。李艷紅等[16]利用紫外線對猴頭菌株HT1進行誘變育種,變異菌株HT65,菌絲體生物量提高率由13.03 g/L提高至21.61 g/L。此外,吳清山[15]通過紫外線誘導猴頭菌株,篩選出的變異菌株經液態(tài)發(fā)酵后菌絲體生物量提高86.5%,達到12.03 g/L,總多糖含量提高35.9%,達到3.27 g/L。

1.2 γ射線輻照誘變

射線輻射誘變主要使細胞發(fā)生DNA發(fā)生斷裂、損傷和堿基缺失等多種生物學效應而促使其產生大的突變[23]。王楠等[19]利用60Co-γ射線輻照誘變猴頭菌株,在輻照劑量為800 Gy和劑量率為27.84 Gy/min的條件下選育出的猴頭菌變異株HE-09,液體培養(yǎng)其生物量和原始菌株相比提高14.2%,菌絲多糖產量提高200%。經過氧化物同工酶電泳分析,誘變菌株HE-09與原始菌株均有相同的譜帶,但出現(xiàn)了不同譜帶和部分相同譜帶濃度不一致的現(xiàn)象,說明誘變菌株與出發(fā)菌株同源但不同株。GONG等[24]在對ATRP誘變的猴頭菌進行多組學分析中發(fā)現(xiàn),變異菌株與原始菌株相比,顯著下調的蛋白質中,過氧化物酶為其中之一。誘變菌株產生的變異可能與過氧化物酶的改變有關。

1.3 超聲波誘變

超聲波的空化、機械和熱效應刺激猴頭菌細胞產生對應激環(huán)境的防御反應,影響與生物體代謝合成途徑相關的基因的表達。此外,利用超聲波空化效應及其次生效應,即高壓高頻瞬變機械效應,可以剪切基因,改變蛋白質表達水平,實現(xiàn)誘變育種[25]。張帥等[17]采用超聲波誘變猴頭菌菌株,經篩選后的猴頭菌變異株H-2,經液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后,菌絲體粗多糖含量提高1.2%。經抑菌性測試,從猴頭菌變異株H-2提取出的子實體多糖對金黃色葡萄球菌有強抑制效果,原菌株提取多糖則對金黃色葡萄球菌無明顯抑制效果。超聲誘導可能影響了多糖結構。

1.4 離子束誘變

ARTP誘變育種技術具有放電均勻且穩(wěn)定、誘變時間短、安全性高、基因突變體的穩(wěn)定性高等特點,主要作用對象為細胞,造成細胞內DNA損傷,從而引發(fā)突變[26]。楊珊等[27]采用ARTP技術對猴頭菌原生質體進行誘變,經重復培養(yǎng)、穩(wěn)定遺傳后,篩選出的變異株猴頭菌321液態(tài)發(fā)酵生物量和多糖含量分別提高了30.37%和47.45%。宋甜甜等[18]在前者的基礎上,對誘變的3株菌株提取的菌絲體多糖進行研究并與原始菌株比較,發(fā)現(xiàn)變異菌株菌絲體多糖結構發(fā)生改變,誘變菌株236的20%醇沉多糖H2P40表現(xiàn)出較好的免疫活性,明顯高于原始菌株。進一步分析顯示,ARTP誘變改變了菌絲體多糖分子量質分布與單糖組成。其中變異菌株大分子多糖比例增加;H4P20與原始菌株菌絲體多糖相比,單糖組成中葡萄糖與甘露糖比例有明顯提高。GONG等[24]進一步對ARTP誘變的猴頭菌株通過多組學分析,發(fā)現(xiàn)編碼UDP-葡萄糖4-差向異構酶的A6180基因片段在猴頭菇突變株中顯著上調,這與突變菌株中多糖的產量較高有關。此外,誘變株Ras-cAMP-PKA途徑的蛋白表達譜顯著降低,而多糖含量顯著增加47.45%。S期阻滯實驗進一步證實Ras-cAMP-PKA途徑的功能障礙可能促進突變株產生高水平的多糖和β-葡聚糖。

低能離子束誘導也是菌株誘變常用方法之一,低能離子束注入會刻蝕細胞,增加細胞通透性,在細胞表面形成孔洞,細胞表面及內部的孔洞和空腔連接成特定通道,使后續(xù)離子深入到遺傳物質,進而產生其他生物學效應[28]。低能離子束誘導具有損傷輕,誘變率高等特點。譚一羅等[21]采用N+離子注入技術誘變猴頭菌孢子,在12×1016ions/cm2,注入能量為15 keV的離子束下成功選育出一株猴頭菌誘變株H1215,生長速率及液體發(fā)酵生物量分別提高了25.30%和30.67%。嚴濤等[20]則采用N+離子注入技術對猴頭菌菌株進行誘變,并進行了高溫耐熱試驗,成功選育出一株能在高溫下生長較快的突變菌株,突變株較原始菌株生長速度提高了44.41%,多糖含量提高了224.42%,總氨基酸含量提高了12.12%。

2 猴頭菌生物活性物質液態(tài)發(fā)酵工藝

培養(yǎng)基的組成與配比直接影響著猴頭菌液態(tài)發(fā)酵菌絲體的形態(tài)與生物活性物質的合成,選擇合適的培養(yǎng)基,是提高液態(tài)發(fā)酵中猴頭菌生物活性物質產量最直觀有效的方法。表2列舉了多種針對猴頭菌特定活性物質所篩選的優(yōu)化培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)在不同品系的猴頭菌之間,營養(yǎng)需求也可能并不相同。面對不同的生物活性產物的需求,所選用的最佳培養(yǎng)基組分也有所區(qū)別,因此,針對不同品系的猴頭菌以及目標活性物質進行液態(tài)發(fā)酵工藝研究很有必要。

表2 猴頭菌在不同培養(yǎng)條件中生物量及代謝物產量Table 2 Biomass and metabolite production of Hericium Erinaceus under different culture conditions

2.1 多糖

多糖作為猴頭菌最主要的活性成分之一,利用液態(tài)發(fā)酵技術生產猴頭菌多糖是主要的研究方向。已有眾多研究人員優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵工藝生產猴頭菌多糖,并研究其生物活性及營養(yǎng)功能。利用液態(tài)發(fā)酵生產的猴頭菌多糖具有生產周期短,產品質量穩(wěn)定等優(yōu)勢。菌絲體多糖和胞外多糖是不同代謝途徑的產物,因此適合它們生產的最佳營養(yǎng)素有所不同[29]。

為了提高菌絲體多糖含量,所選用培養(yǎng)基必須同時促進菌絲體發(fā)育和代謝產物合成。菌絲體多糖含量和組成受碳源種類的影響比較顯著。汪敬健等[30]在進行猴頭菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)現(xiàn),以葡萄糖和可溶性淀粉為碳源時,均可以獲得較高的菌絲體生物量,而發(fā)酵培養(yǎng)基以可溶性淀粉為碳源時,菌絲體多糖含量最高。速效碳源(葡萄糖、麥芽糖等)搭配復合碳源(玉米粉、山藥粉等)是一種更有效的培養(yǎng)基,不僅兼顧前期菌絲體發(fā)育,也解決了后期代謝產物合成后勁不足的問題。例如,信文娟等[31]優(yōu)化猴頭菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基,相比其他碳源,發(fā)現(xiàn)葡萄糖與山藥粉組成的復合碳源培養(yǎng)的菌絲體量和多糖產量最高,可達0.95 g/L,多糖含量為52.5 mg/g。張筱梅等[32]選用2%葡萄糖、0.5%酵母膏、2%麥麩、2%玉米粒、1%(均為質量分數)豆粉作為培養(yǎng)基碳氮源,在26 ℃、pH 5.0條件下對猴頭菌進行罐批發(fā)酵,菌絲體多糖含量可達130 mg/g,產量最高可達1.38 g/L。

除菌絲體多糖外,猴頭菌胞外多糖的分泌受碳源和氮源影響都顯著,這可能與胞外多糖復雜的轉化過程有關。MALINOWSKA等[29]在碳源篩選過程中,發(fā)現(xiàn)蔗糖有利于提高胞外多糖產量,但影響了菌絲體生長量,這一結果同樣與汪敬健等[30]的研究相似;此外,研究還發(fā)現(xiàn)麥芽提取物能同時促進菌絲體生長和胞外多糖分泌。在氮源方面,無機氮源促進了胞外多糖的合成,卻抑制了菌絲體生長,因為它無法提供菌絲體生長所需要的必需氨基酸。最近,萬寧威等[33]研究對比多種營養(yǎng)素,發(fā)現(xiàn)復雜的碳氮源更利于猴頭菌發(fā)酵,提高猴頭菌發(fā)酵液營養(yǎng)成分的最佳碳源為可溶性淀粉和玉米粉,氮源為酵母浸粉和山藥汁,胞外多糖產量達到5.12 g/L。在單因素試驗篩選碳氮源過程中,復合組碳氮源均比單一組分的碳氮源(如葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等)更適合促進猴頭菌胞外多糖的分泌。值得注意的是,猴頭菌在這些含淀粉的培養(yǎng)基中生長速率和活性物質產量都有所提高,適合在工廠化生產中獲得富含多糖的高質量猴頭菌菌粉及發(fā)酵液等粗產物,作為藥用材料或食品輔料。但若其中的淀粉未被完全利用,則會對猴頭菌胞外活性多糖后續(xù)的分離純化增加一定難度。

2.2 猴頭菌素

猴頭菌素(erinacine)主要是一類Cyathane型二萜化合物,液態(tài)發(fā)酵過程中主要在菌絲體中富集,也有少量在猴頭菌發(fā)酵液中被發(fā)現(xiàn)(猴頭菌素E和Q)。目前發(fā)現(xiàn)的20種猴頭菌素化學結構如圖1所示。猴頭菌素具有刺激神經生長因子合成的生物活性,可用于治療神經退行性疾病和周圍神經病。到目前為止,已分離鑒定出20種左右的猴頭菌素(猴頭菌素A～K、P～V和Z1、Z2)(圖1),進一步研究表明其具有不同的神經保護活性,例如促進神經生長因子釋放(猴頭菌素A～I)、減少β淀粉樣蛋白沉積、增加胰島素降解酶的表達(猴頭菌素A和S)或止痛(猴頭菌素E)[34]。猴頭菌素A已被證實具有抗腫瘤活性,研究人員發(fā)現(xiàn)猴頭菌素A可以在體外抑制DLD-1細胞的增殖,并在體內抑制DLD-1細胞的生長[35]。猴頭菌素雖然能通過化學合成,但是其步驟繁瑣,易產生副產物[34],液態(tài)發(fā)酵是猴頭菌素增產的重要途徑。因此,優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵生產猴頭菌素工藝非常必要。

圖1 二十種猴頭菌素化學結構Fig.1 Chemical structures of 20 erinacines

目前,主要針對與猴頭菌素A與猴頭菌素C液體發(fā)酵及優(yōu)化的研究比較多,這可能與它們在菌絲體中含量較高有關。KRZYCZKOWSKI等[36]發(fā)現(xiàn)pH 4～5的環(huán)境可能是促進猴頭菌素A合成的有利因素,最適的碳氮源分別為葡萄糖和酪蛋白胨,并采用中心復合旋轉設計法優(yōu)化了培養(yǎng)基,采用最適培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖69.87,酪蛋白胨11.17,氯化鈉1.45,硫酸鋅0.055,磷酸二氫鉀1.0,pH 4.5;25 ℃下,在10 L生物反應器中可獲得192.73 mg/L的猴頭菌素A。CHANG等[7]在前者研究基礎上,額外添加了亞鐵、銅、錳、鎳金屬離子,猴頭菌素A產量提高到225.54 mg/L。在大型發(fā)酵罐生產實例中,LI等[37]用20 t發(fā)酵罐生產猴頭菌素,優(yōu)化培養(yǎng)基由0.25% 酵母膏、4.5%葡萄糖、0.5%黃豆粉、0.25%蛋白胨和0.05%(均為質量分數)硫酸鎂組成,pH 4.5,溫度為25 ℃。在發(fā)酵12 d后,觀察到猴頭菌素A的積累產量最高為5 mg/g干菌絲體。

在優(yōu)化猴頭菌素C發(fā)酵培養(yǎng)基研究中,WOLTERS等[8]發(fā)現(xiàn),燕麥片和Edamin@K(一種水解乳清蛋白)是增加猴頭菌素C產量的關鍵。其采用最適培養(yǎng)基組成為燕麥片5 g/L,碳酸鈣1.5 g/L,EDamin@K 0.5 g/L,pH 7.5,培養(yǎng)6 d后猴頭菌素C質量濃度可達2.73 g/L。但是在其方法中,是將一級種子液離心濃縮去除預培養(yǎng)基組分,菌絲體再以體積比5∶10的接種量接種至主發(fā)酵培養(yǎng)基中。但該方法只適用于實驗室小規(guī)模研究培養(yǎng),不適用于工廠化大規(guī)模發(fā)酵生產,因為高濃度液體種子難以適應大型生物反應器的無菌操作[34]。WOLTERS等[38]進一步研究還發(fā)現(xiàn),采用酸化處理后的啤酒糟和小麥麩皮可作為產猴頭菌素C的培養(yǎng)基原料,猴頭菌經酸化啤酒糟基質和酸化小麥麩皮基質預培養(yǎng)后,采用上述方法接種至主發(fā)酵培養(yǎng)基,其中采用酸化啤酒糟預培養(yǎng)的猴頭菌素C含量為174.8 mg/g菌絲體干重,采用小麥麩皮預培養(yǎng)的猴頭菌素C含量為99.3 mg/g菌絲體干重,這對利用加工廢棄副產物利用有重要意義。

2.3 甾醇

猴頭菌中甾醇類物質主要為麥角甾醇及其衍生物,麥角甾醇具有抗炎作用,在體內還可以通過代謝轉換成骨化二醇的活性形式,起到調節(jié)機體代謝作用。LI等[39]從猴頭菌菌絲體的甲醇提取物中分離得到11種麥角烷型脂肪酸酯,其中Erinarol A～I為新發(fā)現(xiàn)的化合物。Erinarol A、B以劑量依賴的方式顯著激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)的轉錄活性,目前,PPAR是設計和開發(fā)治療2型糖尿病和代謝綜合征激動劑的治療靶點。

研究發(fā)現(xiàn),可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基提高猴頭菌中甾醇類物質的產量。杜嬌[40]采用優(yōu)化培養(yǎng)基:3.3%葡萄糖、0.3%蛋白胨、0.15%硫酸鎂、3.2%(均為質量分數)豆粕粉,在pH 5.0～5.5,溫度25 ℃條件下,猴頭菌麥角甾醇產量最高為57.77 mg/L。與前者不同的是,張忠等[41]研究了猴頭菇高產麥角甾醇液態(tài)發(fā)酵工藝,采用0.74%葡萄糖、0.66%(質量分數)麥芽浸粉作為復合碳源,1.8%(質量分數)酵母自溶粉為氮源,配備液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,在26 ℃,pH自然的條件下,麥角甾醇含量可達到69.79 mg/L。在對誘變后菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化方面,蔡佳佳等[42]通過紫外線誘變育種,篩選出一株高產麥角甾醇的猴頭菌菌株,在優(yōu)化培養(yǎng)基:葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.075%、蛋白胨1%(均為質量分數)、起始pH值5.0,溫度23 ℃條件下,發(fā)酵獲得菌絲體粉麥角甾醇含量高達18.44 mg/g,總產量可達到114.79 mg/L。上述研究均發(fā)現(xiàn),適合猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產麥角甾醇的最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為酵母膏和蛋白胨,額外添加麥芽浸粉、豆粨粉等復雜碳氮源均有助于提高麥角甾醇產量。除此之外,誘變育種技術對提升猴頭菌麥角甾醇的產量有顯著作用。

2.4 其他活性物質

猴頭菌液態(tài)發(fā)酵還可以生產糖苷酶類,杜嬌等[45]研究猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)條件,以3%豆粕粉、2.3%葡萄糖、1.9%蛋白胨、0.3%(均為質量分數)氯化鎂為優(yōu)化培養(yǎng)基,在pH 5.0～6.0,溫度25 ℃條件下,培養(yǎng)發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶活性可達1.178 U/mL,較未優(yōu)化前提高48.9%。

在猴頭菌菌絲體中,還分離鑒定出如酚類、吡喃酮類、生物堿類等化合物。KOBAYASHI等[46]發(fā)現(xiàn)酚類物質Hericene A～C具有一定的生物活性作用,Hericene A對Hela細胞以及α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性,Hericenes B和C對毒胡蘿卜素誘導的內質網應激依賴性細胞凋亡具有一定的保護作用。汪楷等[47]針對猴頭菌屬次級代謝產物(hericenes、erinapyrones和erinacerins等)已有較多闡述,但針對這些活性物質的優(yōu)化發(fā)酵還尚未見報道,這可能與其在猴頭菌發(fā)酵產物中含量過低有關。

3 發(fā)酵誘導技術

為了高效生產目標次生代謝產物,需要刺激細胞的生物合成,最常用的方法是選擇各種合適的誘導子[48]。誘變育種技術與發(fā)酵工藝優(yōu)化均能顯著提升液態(tài)發(fā)酵中生物活性物質的產量,但誘變育種技術存在一定不確定性,發(fā)酵工藝優(yōu)化方法也有一定局限性,誘導發(fā)酵技術成為了新的突破方向,并能與前兩種技術發(fā)揮協(xié)同作用。誘導子是一類特殊觸發(fā)因子,它能觸發(fā)真菌細胞對脅迫做出一系列的防御反應,調控代謝過程中酶的活性,從而增加植物次生代謝產物的合成[14]。根據來源不同,誘導子可分為兩種類型,即生物誘導子與非生物誘導子,非生物誘導子又分為物理誘導子和化學誘導子。關于利用誘導子在猴頭菌發(fā)酵領域中還僅有少量研究,如表3所示,本文在此將介紹猴頭菌及其他幾種食用菌的研究作為參考,以期在未來借鑒采用更多誘導方式應用于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵研究。

表3 猴頭菌及其他食藥用菌的液態(tài)發(fā)酵誘導影響Table 3 Effect of liquid fermentation induction on Hericium Erinaceus and other edible and medicinal mushrooms

3.1 物理誘導

物理誘導因素通常有光照、干旱、高低溫脅迫等。LU等[49]研究不同光源誘導中華美味蘑菇產生胞外多糖,通過比較6種光源發(fā)現(xiàn),藍光是最適合中華美味蘑菇在液態(tài)發(fā)酵中促進胞外多糖生產的誘導光源。藍光照射誘導顯著提高了胞外多糖的產量,與黑暗環(huán)境下相比胞外多糖產率提高了42%。

近年來,弱磁場應用于微生物培養(yǎng)展現(xiàn)出良好的應用前景。磁場處理會影響細胞的微觀結構;它會導致細胞膜脂質流動性的加速,從而使細胞能夠對外部應激刺激做出反應,從而保護細胞內部。細胞膜通透性的增加,也讓細胞能吸收更多營養(yǎng)物質,增加分泌代謝產物能力[25]。研究表明,磁場能促進猴頭菌的生長和胞外多糖的分泌。高夢祥等[50]在猴頭菌液態(tài)發(fā)酵過程中,利用低交變磁場誘導,與對照組相比,發(fā)現(xiàn)菌絲體干重增長率達140.1%,菌體胞外多糖質量濃度增長率達271.7%。磁場作用影響了細胞的微觀結構,經過放大觀察,菌絲體在磁場影響下,結構變疏松,這種結構更利于菌絲體與外界物質的交換[51]。

3.2 化學誘導

常用的化學誘導子有植物生長調節(jié)劑、重金屬離子、油脂類物質、信號分子刺激物等?；瘜W誘導子具有快速、穩(wěn)定、專一性強等優(yōu)勢,可以選擇性誘導食用菌特定基因的表達,從而實現(xiàn)代謝產物的積累[52]。DAI等[53]利用水楊酸和茉莉酸甲酯調控猴頭菌生產麥角甾醇,在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的茉莉酸甲酯,猴頭菌菌絲體中麥角甾醇含量提高了25.8%。除添加刺激物外,添加表面活性劑也是重要手段之一。OKUMURA等[54]采用吐溫80誘導猴頭菌菌絲體發(fā)酵,可以顯著增加細胞膜的通透性,有利于營養(yǎng)物質的吸收、胞外多糖的生物合成和胞外多糖分泌。經吐溫80誘導,收獲的干菌絲體量相較對照組提高了118%,β-葡聚糖產量相較對照組提高了87%。

信號分子誘導也是化學誘導的重要途徑,如法尼醇作為真菌中的群體感應分子,可以通過促進多糖的生物合成和調節(jié)菌絲形態(tài)而顯著提高胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)產量。法尼醇使雜色木霉菌絲發(fā)育成蓬松、疏松的多菌絲形態(tài),有利于胞內多糖向培養(yǎng)基內排泄[55]。WANG等[56]通過外源添加群體感應分子法尼醇來提高灰樹花液體發(fā)酵EPS的產量、抗氧化活性和抗腫瘤活性,經法尼醇誘導,EPS產量為1.25 g/L,比對照提高150%,通過分級醇沉出4種多糖組分,EPS-F-0.2M具有最高的抗氧化和抗腫瘤活性,說明法尼醇可能通過影響結構和性質來調節(jié)EPS的生物活性。這可為法尼醇在誘導猴頭菌液態(tài)發(fā)酵提供參考。

3.3 生物誘導

生物誘導子是指來源于動植物細胞或微生物中的物質,包括細菌、真菌、酵母提取物、細胞壁成分、代謝產物、蛋白質和脂類等。例如,YANG等[57]通過人工神經網絡優(yōu)化猴頭菌、雙孢菇和雞腿菇菌絲體共發(fā)酵產蒽醌,相比單種食用菌組合發(fā)酵,產率要明顯提高。蒽醌產率從0.55%～0.97%大大提高至2.11%。此外,MA等[58]發(fā)現(xiàn),在牛樟芝液態(tài)發(fā)酵第7天,添加橘子皮提取物,可顯著促進多酚和三萜類化合物產生,這可能與橘子皮中的柑橘精油含大量萜烯類物質有關。并且,牛樟樹皮提取物也被證實能有效促進牛樟芝菌絲體生長和生物活性物質的產量[59]。目前,利用生物誘導子促進猴頭菌液態(tài)發(fā)酵產次生代謝產物的研究還很少,生物誘導調控在液態(tài)發(fā)酵中效率高、符合綠色生產原則,還能實現(xiàn)資源的可再生利用。猴頭菌中次生代謝產物種類豐富,可利用的活性價值高,利用誘導策略促進猴頭菌高價值的次生代謝產物發(fā)酵生產是猴頭菌液態(tài)發(fā)酵研究的一大趨勢。

4 總結與展望

猴頭菌自古以來就以其味道鮮美、生物活性高而廣受關注。為了滿足猴頭菌產量日益增長的需求,液態(tài)發(fā)酵為猴頭菌及其活性物質提供了一種高效的生產途徑,具有廣闊的工業(yè)應用前景和極高的經濟價值。本文從菌株選育、發(fā)酵工藝以及誘導調控3個方面對猴頭菌液態(tài)發(fā)酵生產活性物質的方法進行了總結和歸納。目前,大多數研究都側重于猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究,而在誘導調控猴頭菌液態(tài)發(fā)酵,促進代謝產物生成方面的研究還較缺乏。近年來,已有研究通過代謝組學分析,確定了猴頭菌中多糖與萜類等物質合成的上游通路和關鍵酶[24,60],這為探索尋找猴頭菌液態(tài)發(fā)酵誘導調控中新的誘導子提供了新的思路。猴頭菌中活性物質的提取、分離、鑒定和功能方面的研究已較有較多闡述,而在開發(fā)和利用高效、綠色、經濟的新誘導技術來提高目標活性產物的發(fā)酵效率,是猴頭菌液態(tài)發(fā)酵領域的發(fā)展趨勢。