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        溫度和精氨酸對(duì)羅氏沼蝦氨基脲檢出量的影響

        2023-11-08 06:10:56高芳芳王迪陳勝軍馮陽(yáng)鄧建朝潘創(chuàng)李春生
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年20期
        關(guān)鍵詞:蝦殼蝦肉沼蝦

        高芳芳,王迪,陳勝軍,馮陽(yáng),鄧建朝,潘創(chuàng),李春生

        1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510300)

        硝基呋喃是一類具有明顯殺菌消毒作用的廣譜抗生素藥物,廣泛用于畜禽和養(yǎng)殖水產(chǎn)品的衛(wèi)生消毒處理[1]。呋喃西林 (nitrofurazon, NFZ) 是硝基呋喃的一種,其在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速,主要代謝物氨基脲 (semicarbazide, SEM) 與動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后形成穩(wěn)定的化合物長(zhǎng)時(shí)間存在于體內(nèi),具有潛在的致畸、致癌和致突變性[2-3]。歐盟于1995年禁止NFZ用于動(dòng)物源食品[4],隨后中國(guó)、日本、美國(guó)等國(guó)家發(fā)布相同禁令,中國(guó)于2003年公布動(dòng)物源性食品中SEM的最大殘留量是1.0 μg/kg,一些國(guó)家殘留限量是0.5 μg/kg[5-6]。水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中NFZ的違規(guī)使用通常通過(guò)檢測(cè)SEM來(lái)確定。研究發(fā)現(xiàn),甲殼類水產(chǎn)品中SEM的檢出不僅是外源物質(zhì)NFZ的代謝產(chǎn)生,還與加工過(guò)程及甲殼類水產(chǎn)品自身某些內(nèi)源性物質(zhì)有關(guān)[7-8]。2003年,SAARI等[9]在野生克氏原螯蝦 (Procambarusclarkii) 中檢測(cè)到SEM的存在,最高檢測(cè)量達(dá)12 μg/kg,首次提出甲殼類水生動(dòng)物內(nèi)源產(chǎn)生SEM這一觀點(diǎn)。MCCRACKEN等[10]對(duì)孟加拉國(guó)野生淡水明蝦 (Macrobrachiumagwi) 研究發(fā)現(xiàn),不同水域蝦體中SEM普遍存在,并且蝦殼中的SEM檢出量是蝦肉中SEM檢出量的幾十倍不等,這與VAN等[11]、王鼎南等[12]、倪永付等[13]檢測(cè)結(jié)果一致。彭婕等[14]在中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis) 脫殼后新長(zhǎng)出的軟殼中檢測(cè)到了SEM而蟹肉中未檢出SEM,推測(cè)水生動(dòng)物甲殼可能是其內(nèi)源性SEM的主要來(lái)源。甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源性SEM的存在得到了大量研究的證實(shí),但其生成機(jī)理缺乏直接有效的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(E.sinensis) 蟹殼中的內(nèi)源性SEM的殘留水平與蟹殼中的蛋白質(zhì)含量及水解氨基酸組成有關(guān)[15]。同時(shí)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)甲殼類水產(chǎn)品在高溫下更容易生成SEM,溫度的高低與SEM的檢出量成正比關(guān)系[16]。深入探討甲殼類水產(chǎn)品中SEM的檢出與結(jié)合氨基酸的關(guān)系發(fā)現(xiàn),精氨酸酶可將精氨酸水解為鳥(niǎo)氨酸和尿素進(jìn)入尿素循環(huán),而尿素和SEM在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性。NOONAN等[17]證實(shí)甲殼類水產(chǎn)品中含量最豐富的氨基酸是精氨酸。對(duì)此YU等[18]在凡納濱對(duì)蝦 (LitopenaeusvannameiBoone) 生長(zhǎng)期間對(duì)參與尿素循環(huán)的相關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)后認(rèn)為蝦體內(nèi)的精氨酸等物質(zhì)通過(guò)尿素循環(huán)最終形成SEM。

        為了進(jìn)一步研究甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源性SEM的生成機(jī)理,本研究以羅氏沼蝦為研究對(duì)象,采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,研究溫度對(duì)羅氏沼蝦SEM檢出的影響。根據(jù)羅氏沼蝦蛋白質(zhì)及水解氨基酸等相關(guān)因素的分布規(guī)律,驗(yàn)證精氨酸對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源SEM生成的相關(guān)性,這對(duì)今后研究甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源SEM的生成機(jī)理具有重要研究意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        羅氏沼蝦成蝦采自廣東肇慶養(yǎng)殖基地,在整個(gè)養(yǎng)殖期間未曾添加NFZ藥物,采集一定數(shù)量后用便攜冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冷凍保存。樣品分析前自然解凍,將去除頭部組織(包括頭胸甲)的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉分離,分別準(zhǔn)確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)凍干處理48 h;分別準(zhǔn)確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)于50、70、100、130、200 ℃下恒溫48 h烘干處理,每次處理做3個(gè)平行,再用微型粉碎機(jī)粉碎(蝦肉60 s;蝦殼120 s)。

        氨基脲標(biāo)準(zhǔn)品(SEM)、氨基脲內(nèi)標(biāo)(SEM-15N2-13C),上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司;甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯(質(zhì)譜純),廣州化學(xué)試劑廠;2-硝基苯甲醛、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉和鹽酸(分析純),廣州化學(xué)試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水為MiliQ超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        TQ-S-MICEO高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,美國(guó)Waters公司;BS 224S電子天平,德國(guó)賽多利斯公司;DZF6050真空干燥箱,上海精宏儀器有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司;Alpha1-4冷凍干燥機(jī),德國(guó)Christ公司;3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器,金壇市精達(dá)儀器制造廠;N-EVAP24氮吹儀,美國(guó)Organomation公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 羅氏沼蝦SEM的測(cè)定[19]

        1.3.1.1 樣品前處理

        將粉碎后的樣品小心完整的移至50 mL離心管中,分別加入100 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作液0.1 mL,0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.2 mL,蝦肉樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液5 mL,蝦殼樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液10 mL,渦旋15 min,在37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫水浴振蕩器,避光衍生16 h。

        衍生后的樣品冷卻至室溫,加2~3 mL磷酸氫二鉀溶液,調(diào)pH至中性,加6 mL乙酸乙酯,渦旋15 min,4 200 r/min離心15 min,取上清液于10 mL離心管,重復(fù)提取操作1次,合并上清液,水浴40 ℃氮?dú)獯蹈?。?.1%甲酸水-乙腈1.5 mL復(fù)溶,正己烷1.5 mL除脂,渦旋10 min,10 000 r/min離心15 min,取下清液過(guò)0.22 μm濾膜,待測(cè)。

        1.3.1.2 儀器工作條件[20]

        a)色譜條件

        色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色譜柱;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸銨溶液(質(zhì)譜純),B為乙腈(質(zhì)譜純);進(jìn)樣量:5.0 μL;柱溫:35 ℃;流速:0.35 mL/min;梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

        表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

        b)質(zhì)譜條件

        離子源:電噴霧電離正離子 (electrospray ionization positive ion, ESI+) 模式掃描;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (multiple-reaction monitoring, MRM) 模式;噴霧電壓:3 500 V;毛細(xì)管電壓:1 000 V;離子源溫度:120 ℃;去溶劑溫度:600 ℃;去溶劑氣流:氮?dú)?流速1 000 L/h;錐孔氣流:氮?dú)?流速為50 L/h。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表2。SEM衍生物總離子流圖及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

        A-總離子流圖;B-質(zhì)譜圖圖1 SEM衍生物總離子流圖及質(zhì)譜圖Fig.1 SEM derivative total ion current and mass spectra

        表2 呋喃西林代謝物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件Table 2 NFZ metabolites and their internal target mass spectrometry conditions

        1.3.2 羅氏沼蝦蛋白質(zhì)的測(cè)定

        為研究不同處理方式下羅氏沼蝦蛋白質(zhì)分解對(duì)SEM的檢出影響,采用考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法) 對(duì)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)[16,21]。

        1.3.3 羅氏沼蝦SEM生成相關(guān)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

        本實(shí)驗(yàn)于室內(nèi)養(yǎng)殖缸進(jìn)行,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,水位和溶解氧保持恒定。羅氏沼蝦蝦苗從廣州當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)獲得,在前期生長(zhǎng)過(guò)程中未曾添加NFZ藥物,須足完整,活潑好動(dòng),育齡1月左右。實(shí)驗(yàn)前于養(yǎng)殖缸內(nèi)暫養(yǎng)1周左右以適應(yīng)環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,對(duì)水體和飼料均進(jìn)行SEM的檢測(cè)。

        選擇平均個(gè)體質(zhì)量為(10.0±2.0) g,體長(zhǎng)(5±1) cm的羅氏沼蝦放入養(yǎng)殖缸中,隨機(jī)分組,養(yǎng)殖密度約為30尾/m3。飼料中精氨酸添加量分別為0、10、30、50 g/kg。按每天喂養(yǎng)100 mg/kg的劑量早晚各投喂1次。分別于第0、10、20、30、40天取羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉部位,按1.3.1節(jié)檢測(cè)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同處理方式對(duì)羅氏沼蝦SEM檢出量的影響

        按1.1節(jié)方法制備樣品,按1.3.1節(jié)方法確認(rèn)樣品中的SEM檢出量。檢出情況見(jiàn)表3和圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表3和圖3) 顯示,未處理的羅氏沼蝦原蝦與不同處理方式下的蝦殼和蝦肉中恒有SEM檢出,蝦殼中的SEM檢出量明顯高于蝦肉中的SEM檢出量(P<0.05),且檢出量均大于1.0 μg/kg。在保證相同質(zhì)量和相同實(shí)驗(yàn)操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的SEM檢出與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無(wú)明顯差異(P>0.05),這說(shuō)明溫度對(duì)羅氏沼蝦SEM檢出量的影響并非是因?yàn)樗譂饪s而引起的。與未經(jīng)處理的原蝦對(duì)比,隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量均不斷上升,其中蝦殼70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而50 ℃與70 ℃差異不顯著(P>0.05),蝦肉50 ℃與70 ℃, 70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而原蝦與50 ℃差異不顯著(P>0.05),這與CAO等[22]結(jié)論相似,因此在對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行SEM檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡可能地將溫度控制在50 ℃以下,以免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成誤差。

        表3 不同處理方式下樣品中SEM的檢出量 單位:μg/kg

        研究發(fā)現(xiàn),SEM是離子型化合物,在高溫狀態(tài)下有一定的熱分解性,熱分解過(guò)程是連續(xù)進(jìn)行的,總共包括1個(gè)吸熱過(guò)程和3個(gè)放熱過(guò)程。SEM在166~178 ℃開(kāi)始第一步熱分解,因此隨著加熱溫度達(dá)到200 ℃,SEM的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)不完整[23],在液質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中未呈現(xiàn)相應(yīng)峰形,如圖2所示。由圖3可以看

        圖2 200 ℃處理下SEM及其內(nèi)標(biāo)總離子流圖Fig.2 SEM and internal standard total ion current diagram under 200 ℃ treatment

        圖3 不同處理方式下SEM的檢出量Fig.3 The detected amount of SEM in samples under different treatment methods注:不同不寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

        出,烘干溫度的高低對(duì)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量有顯著影響,總體表現(xiàn)為隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量逐漸上升,相比于蝦肉,蝦殼中的SEM檢出量基數(shù)更大,因此蝦殼SEM檢出量受溫度影響更大。

        2.2 不同處理方式對(duì)羅氏沼蝦蛋白質(zhì)含量的影響

        采用Bradford 法對(duì)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中所含蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)分析,用系列濃度蛋白繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的回歸曲線方程為y=0.053 1x+0.016,R2=0.992 9 (圖4)。研究發(fā)現(xiàn)不同處理方式對(duì)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉的蛋白質(zhì)含量影響不同,在保證相同質(zhì)量和相同實(shí)驗(yàn)操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的蛋白質(zhì)含量與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無(wú)明顯差異 (P>0.05),與未經(jīng)處理的原蝦對(duì)比,隨著加工溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的蛋白含量逐漸下降,不同加工溫度下的蛋白含量存在顯著性差異 (P<0.05),具體結(jié)果見(jiàn)表4和圖5。將同一處理方式的羅氏沼蝦不同部位中蛋白質(zhì)含量與其SEM檢出量比較,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量最高的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量最低,而蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量卻相對(duì)較高。以SEM檢出量和蛋白質(zhì)含量繪制曲線,如圖5所示,曲線相關(guān)系數(shù)為負(fù)值(P<0.05),說(shuō)明蛋白質(zhì)含量與SEM檢出濃度呈相反趨勢(shì),這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其蛋白質(zhì)的含量也可能相關(guān),樣品中蛋白質(zhì)含量越高,其SEM檢出量越低。

        圖4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Protein standard curve

        A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖5 羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與蛋白質(zhì)含量相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of semicarbazide concentration and protein content in different tissues of M.rosenbergii

        表4不同處理方式下樣品中蛋白含量Table 4 Protein content in samples under different treatments

        2.3 精氨酸對(duì)羅氏沼蝦中SEM檢出量的影響

        通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證明,羅氏沼蝦SEM的檢出與溫度變化顯著相關(guān),結(jié)合相關(guān)研究,溫度的改變引起的蛋白質(zhì)變化是影響SEM檢出變化的主要因素。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位,蛋白質(zhì)通過(guò)各種酶的聯(lián)合作用分解成氨基酸。另有研究證明,SEM的生成與氨基酸組成有關(guān),SEM是由含氮物質(zhì) (如精氨酸、組氨酸、瓜氨酸和肌酐) 與酰胺或尿素反應(yīng)形成[24-25]。對(duì)上述研究與結(jié)論,本實(shí)驗(yàn)精氨酸對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源SEM生成的影響見(jiàn)圖6。如圖6所示,隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng),羅氏沼蝦蝦殼內(nèi)的SEM檢出量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),而蝦肉中的SEM檢出量無(wú)明顯變化趨勢(shì)。這可能是由于羅氏沼蝦初期攝入優(yōu)質(zhì)蛋白飼料后迅速進(jìn)入成長(zhǎng)期,蝦殼中的SEM檢出量隨著蝦體的生長(zhǎng)也隨之升高,隨著蝦體的生長(zhǎng)進(jìn)入頻繁的蛻殼期,蝦體不斷蛻殼致使蝦殼中的SEM難以完整富集,SEM檢出量隨之下降。羅氏沼蝦蝦肉在整個(gè)養(yǎng)殖期間恒有SEM檢出,并且隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng),蝦肉中的SEM檢出量無(wú)顯著差異 (P>0.05)。由圖6可以看出,隨著飼料中攝入精氨酸的含量增加,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的檢出量也隨之增加,不同含量精氨酸飼料喂養(yǎng)的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM檢出量存在顯著性差異 (P<0.05)。將不同生長(zhǎng)時(shí)期的羅氏沼蝦不同組織的SEM檢出量與攝入的精氨酸含量做相關(guān)性分析,以SEM檢出量和精氨酸含量繪制曲線,結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可以看出,精氨酸含量與SEM檢出量呈正相關(guān),這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其攝入的精氨酸含量相關(guān),精氨酸能促進(jìn)羅氏沼蝦體內(nèi)SEM的生成,樣品中精氨酸含量越高,其SEM檢出量越高。

        圖6 精氨酸對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出量的影響Fig.6 Effect of arginine on endogenous SEM detection of Macrobrachium rosenbergii注:大寫不同字母表示不同含量的精氨酸對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出差異顯著(P<0.05);小寫不同字母表示養(yǎng)殖時(shí)間對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出差異顯著(P<0.05)。

        A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖7 不同生長(zhǎng)期羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與精氨酸含量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between SEM detection amount and arginine content in different tissues of M.rosenbergii in different growth stages

        3 結(jié)論與討論

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同處理方式下的羅氏沼蝦的蝦殼和蝦肉中的SEM進(jìn)行檢測(cè),得出隨著烘干溫度的升高,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的蛋白質(zhì)含量逐漸降低,而蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量卻隨之升高,這說(shuō)明烘干溫度對(duì)羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM的生成有促進(jìn)作用,在對(duì)羅氏沼蝦等甲殼類水產(chǎn)品進(jìn)行NFZ的檢測(cè)時(shí),應(yīng)盡可能避免蝦殼等甲殼物質(zhì)混入其中,同時(shí)避免檢測(cè)溫度高于50 ℃。通過(guò)對(duì)羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中氨基酸的分析,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)人工喂養(yǎng)精氨酸混合飼料的方式探索羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM生成的可能影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng),羅氏沼蝦蝦殼內(nèi)的SEM呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),蝦肉中的SEM檢出量無(wú)明顯變化趨勢(shì)。攝入不同含量精氨酸的羅氏沼蝦,蝦殼和蝦肉SEM檢出量分別存在顯著性差異 (P<0.05),這說(shuō)明精氨酸能夠促進(jìn)羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM的生成。

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