高芳芳,王迪,陳勝軍,馮陽,鄧建朝,潘創(chuàng),李春生

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300)

硝基呋喃是一類具有明顯殺菌消毒作用的廣譜抗生素藥物,廣泛用于畜禽和養(yǎng)殖水產(chǎn)品的衛(wèi)生消毒處理[1]。呋喃西林 (nitrofurazon, NFZ) 是硝基呋喃的一種,其在動物體內(nèi)代謝迅速,主要代謝物氨基脲 (semicarbazide, SEM) 與動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后形成穩(wěn)定的化合物長時間存在于體內(nèi),具有潛在的致畸、致癌和致突變性[2-3]。歐盟于1995年禁止NFZ用于動物源食品[4],隨后中國、日本、美國等國家發(fā)布相同禁令,中國于2003年公布動物源性食品中SEM的最大殘留量是1.0 μg/kg,一些國家殘留限量是0.5 μg/kg[5-6]。水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中NFZ的違規(guī)使用通常通過檢測SEM來確定。研究發(fā)現(xiàn),甲殼類水產(chǎn)品中SEM的檢出不僅是外源物質(zhì)NFZ的代謝產(chǎn)生,還與加工過程及甲殼類水產(chǎn)品自身某些內(nèi)源性物質(zhì)有關[7-8]。2003年,SAARI等[9]在野生克氏原螯蝦 (Procambarusclarkii) 中檢測到SEM的存在,最高檢測量達12 μg/kg,首次提出甲殼類水生動物內(nèi)源產(chǎn)生SEM這一觀點。MCCRACKEN等[10]對孟加拉國野生淡水明蝦 (Macrobrachiumagwi) 研究發(fā)現(xiàn),不同水域蝦體中SEM普遍存在,并且蝦殼中的SEM檢出量是蝦肉中SEM檢出量的幾十倍不等,這與VAN等[11]、王鼎南等[12]、倪永付等[13]檢測結(jié)果一致。彭婕等[14]在中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis) 脫殼后新長出的軟殼中檢測到了SEM而蟹肉中未檢出SEM,推測水生動物甲殼可能是其內(nèi)源性SEM的主要來源。甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源性SEM的存在得到了大量研究的證實,但其生成機理缺乏直接有效的科學實驗依據(jù)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(E.sinensis) 蟹殼中的內(nèi)源性SEM的殘留水平與蟹殼中的蛋白質(zhì)含量及水解氨基酸組成有關[15]。同時有學者研究發(fā)現(xiàn)甲殼類水產(chǎn)品在高溫下更容易生成SEM,溫度的高低與SEM的檢出量成正比關系[16]。深入探討甲殼類水產(chǎn)品中SEM的檢出與結(jié)合氨基酸的關系發(fā)現(xiàn),精氨酸酶可將精氨酸水解為鳥氨酸和尿素進入尿素循環(huán),而尿素和SEM在結(jié)構上有一定的相似性。NOONAN等[17]證實甲殼類水產(chǎn)品中含量最豐富的氨基酸是精氨酸。對此YU等[18]在凡納濱對蝦 (LitopenaeusvannameiBoone) 生長期間對參與尿素循環(huán)的相關物質(zhì)含量進行檢測后認為蝦體內(nèi)的精氨酸等物質(zhì)通過尿素循環(huán)最終形成SEM。

為了進一步研究甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源性SEM的生成機理,本研究以羅氏沼蝦為研究對象,采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,研究溫度對羅氏沼蝦SEM檢出的影響。根據(jù)羅氏沼蝦蛋白質(zhì)及水解氨基酸等相關因素的分布規(guī)律,驗證精氨酸對羅氏沼蝦內(nèi)源SEM生成的相關性,這對今后研究甲殼類水產(chǎn)品中內(nèi)源SEM的生成機理具有重要研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅氏沼蝦成蝦采自廣東肇慶養(yǎng)殖基地,在整個養(yǎng)殖期間未曾添加NFZ藥物,采集一定數(shù)量后用便攜冰箱運回實驗室-80 ℃超低溫冷凍保存。樣品分析前自然解凍,將去除頭部組織(包括頭胸甲)的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉分離,分別準確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)凍干處理48 h;分別準確稱取蝦殼和蝦肉樣品2.00 g(精確到0.01 g)于50、70、100、130、200 ℃下恒溫48 h烘干處理,每次處理做3個平行,再用微型粉碎機粉碎(蝦肉60 s;蝦殼120 s)。

氨基脲標準品(SEM)、氨基脲內(nèi)標(SEM-15N2-13C),上海安譜璀世標準技術服務有限公司;甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯(質(zhì)譜純),廣州化學試劑廠;2-硝基苯甲醛、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉和鹽酸(分析純),廣州化學試劑廠;實驗用水為MiliQ超純水。

1.2 儀器與設備

TQ-S-MICEO高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,美國Waters公司;BS 224S電子天平,德國賽多利斯公司;DZF6050真空干燥箱,上海精宏儀器有限公司;TDZ5-WS臺式低速離心機,長沙湘儀儀器有限公司;Alpha1-4冷凍干燥機,德國Christ公司;3K30臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器,金壇市精達儀器制造廠;N-EVAP24氮吹儀,美國Organomation公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羅氏沼蝦SEM的測定[19]

1.3.1.1 樣品前處理

將粉碎后的樣品小心完整的移至50 mL離心管中,分別加入100 ng/mL內(nèi)標工作液0.1 mL,0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.2 mL,蝦肉樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液5 mL,蝦殼樣品中加入0.2 mol/L鹽酸溶液10 mL,渦旋15 min,在37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的恒溫水浴振蕩器,避光衍生16 h。

衍生后的樣品冷卻至室溫,加2～3 mL磷酸氫二鉀溶液,調(diào)pH至中性,加6 mL乙酸乙酯,渦旋15 min,4 200 r/min離心15 min,取上清液于10 mL離心管,重復提取操作1次,合并上清液,水浴40 ℃氮氣吹干。加0.1%甲酸水-乙腈1.5 mL復溶,正己烷1.5 mL除脂,渦旋10 min,10 000 r/min離心15 min,取下清液過0.22 μm濾膜,待測。

1.3.1.2 儀器工作條件[20]

a)色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色譜柱;流動相:A為0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸銨溶液(質(zhì)譜純),B為乙腈(質(zhì)譜純);進樣量:5.0 μL;柱溫:35 ℃;流速:0.35 mL/min;梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

b)質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離正離子 (electrospray ionization positive ion, ESI+) 模式掃描;掃描方式:多反應監(jiān)測 (multiple-reaction monitoring, MRM) 模式;噴霧電壓:3 500 V;毛細管電壓:1 000 V;離子源溫度:120 ℃;去溶劑溫度:600 ℃;去溶劑氣流:氮氣,流速1 000 L/h;錐孔氣流:氮氣,流速為50 L/h。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見表2。SEM衍生物總離子流圖及質(zhì)譜圖見圖1。

A-總離子流圖;B-質(zhì)譜圖圖1 SEM衍生物總離子流圖及質(zhì)譜圖Fig.1 SEM derivative total ion current and mass spectra

表2 呋喃西林代謝物及其內(nèi)標的質(zhì)譜條件Table 2 NFZ metabolites and their internal target mass spectrometry conditions

1.3.2 羅氏沼蝦蛋白質(zhì)的測定

為研究不同處理方式下羅氏沼蝦蛋白質(zhì)分解對SEM的檢出影響,采用考馬斯亮藍法 (Bradford法) 對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉進行蛋白質(zhì)檢測[16,21]。

1.3.3 羅氏沼蝦SEM生成相關性驗證實驗

本實驗于室內(nèi)養(yǎng)殖缸進行,在整個實驗期間,水位和溶解氧保持恒定。羅氏沼蝦蝦苗從廣州當?shù)仞B(yǎng)殖場獲得,在前期生長過程中未曾添加NFZ藥物,須足完整,活潑好動,育齡1月左右。實驗前于養(yǎng)殖缸內(nèi)暫養(yǎng)1周左右以適應環(huán)境。正式實驗開始前,對水體和飼料均進行SEM的檢測。

選擇平均個體質(zhì)量為(10.0±2.0) g,體長(5±1) cm的羅氏沼蝦放入養(yǎng)殖缸中,隨機分組,養(yǎng)殖密度約為30尾/m3。飼料中精氨酸添加量分別為0、10、30、50 g/kg。按每天喂養(yǎng)100 mg/kg的劑量早晚各投喂1次。分別于第0、10、20、30、40天取羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉部位,按1.3.1節(jié)檢測羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對羅氏沼蝦SEM檢出量的影響

按1.1節(jié)方法制備樣品,按1.3.1節(jié)方法確認樣品中的SEM檢出量。檢出情況見表3和圖3。實驗結(jié)果 (表3和圖3) 顯示,未處理的羅氏沼蝦原蝦與不同處理方式下的蝦殼和蝦肉中恒有SEM檢出,蝦殼中的SEM檢出量明顯高于蝦肉中的SEM檢出量(P<0.05),且檢出量均大于1.0 μg/kg。在保證相同質(zhì)量和相同實驗操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的SEM檢出與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無明顯差異(P>0.05),這說明溫度對羅氏沼蝦SEM檢出量的影響并非是因為水分濃縮而引起的。與未經(jīng)處理的原蝦對比,隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量均不斷上升,其中蝦殼70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而50 ℃與70 ℃差異不顯著(P>0.05),蝦肉50 ℃與70 ℃, 70 ℃和100 ℃,100 ℃和130 ℃烘干條件下的SEM檢出量存在顯著性差異(P<0.05),而原蝦與50 ℃差異不顯著(P>0.05),這與CAO等[22]結(jié)論相似,因此在對水產(chǎn)品進行SEM檢測時應盡可能地將溫度控制在50 ℃以下,以免對實驗結(jié)果造成誤差。

表3 不同處理方式下樣品中SEM的檢出量 單位:μg/kg

研究發(fā)現(xiàn),SEM是離子型化合物,在高溫狀態(tài)下有一定的熱分解性,熱分解過程是連續(xù)進行的,總共包括1個吸熱過程和3個放熱過程。SEM在166～178 ℃開始第一步熱分解,因此隨著加熱溫度達到200 ℃,SEM的分子結(jié)構已經(jīng)不完整[23],在液質(zhì)檢測過程中未呈現(xiàn)相應峰形,如圖2所示。由圖3可以看

圖2 200 ℃處理下SEM及其內(nèi)標總離子流圖Fig.2 SEM and internal standard total ion current diagram under 200 ℃ treatment

圖3 不同處理方式下SEM的檢出量Fig.3 The detected amount of SEM in samples under different treatment methods注:不同不寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

出,烘干溫度的高低對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量有顯著影響,總體表現(xiàn)為隨著烘干溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量逐漸上升,相比于蝦肉,蝦殼中的SEM檢出量基數(shù)更大,因此蝦殼SEM檢出量受溫度影響更大。

2.2 不同處理方式對羅氏沼蝦蛋白質(zhì)含量的影響

采用Bradford 法對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中所含蛋白進行定量檢測分析,用系列濃度蛋白繪制蛋白質(zhì)標準曲線,得到的回歸曲線方程為y=0.053 1x+0.016,R2=0.992 9 (圖4)。研究發(fā)現(xiàn)不同處理方式對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉的蛋白質(zhì)含量影響不同,在保證相同質(zhì)量和相同實驗操作條件下,凍干處理的蝦殼和蝦肉中的蛋白質(zhì)含量與未處理原蝦蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量無明顯差異 (P>0.05),與未經(jīng)處理的原蝦對比,隨著加工溫度的升高,蝦殼和蝦肉中的蛋白含量逐漸下降,不同加工溫度下的蛋白含量存在顯著性差異 (P<0.05),具體結(jié)果見表4和圖5。將同一處理方式的羅氏沼蝦不同部位中蛋白質(zhì)含量與其SEM檢出量比較,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量最高的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量最低,而蛋白質(zhì)含量相對較低的蝦殼和蝦肉中SEM檢出量卻相對較高。以SEM檢出量和蛋白質(zhì)含量繪制曲線,如圖5所示,曲線相關系數(shù)為負值(P<0.05),說明蛋白質(zhì)含量與SEM檢出濃度呈相反趨勢,這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其蛋白質(zhì)的含量也可能相關,樣品中蛋白質(zhì)含量越高,其SEM檢出量越低。

圖4 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.4 Protein standard curve

A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖5 羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與蛋白質(zhì)含量相關性分析Fig.5 Correlation analysis of semicarbazide concentration and protein content in different tissues of M.rosenbergii

表4不同處理方式下樣品中蛋白含量Table 4 Protein content in samples under different treatments

2.3 精氨酸對羅氏沼蝦中SEM檢出量的影響

通過上述實驗證明,羅氏沼蝦SEM的檢出與溫度變化顯著相關,結(jié)合相關研究,溫度的改變引起的蛋白質(zhì)變化是影響SEM檢出變化的主要因素。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構成單位,蛋白質(zhì)通過各種酶的聯(lián)合作用分解成氨基酸。另有研究證明,SEM的生成與氨基酸組成有關,SEM是由含氮物質(zhì) (如精氨酸、組氨酸、瓜氨酸和肌酐) 與酰胺或尿素反應形成[24-25]。對上述研究與結(jié)論,本實驗精氨酸對羅氏沼蝦內(nèi)源SEM生成的影響見圖6。如圖6所示,隨著養(yǎng)殖時間的延長,羅氏沼蝦蝦殼內(nèi)的SEM檢出量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,而蝦肉中的SEM檢出量無明顯變化趨勢。這可能是由于羅氏沼蝦初期攝入優(yōu)質(zhì)蛋白飼料后迅速進入成長期,蝦殼中的SEM檢出量隨著蝦體的生長也隨之升高,隨著蝦體的生長進入頻繁的蛻殼期,蝦體不斷蛻殼致使蝦殼中的SEM難以完整富集,SEM檢出量隨之下降。羅氏沼蝦蝦肉在整個養(yǎng)殖期間恒有SEM檢出,并且隨著養(yǎng)殖時間的延長,蝦肉中的SEM檢出量無顯著差異 (P>0.05)。由圖6可以看出,隨著飼料中攝入精氨酸的含量增加,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的檢出量也隨之增加,不同含量精氨酸飼料喂養(yǎng)的羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM檢出量存在顯著性差異 (P<0.05)。將不同生長時期的羅氏沼蝦不同組織的SEM檢出量與攝入的精氨酸含量做相關性分析,以SEM檢出量和精氨酸含量繪制曲線,結(jié)果見圖7。由圖7可以看出,精氨酸含量與SEM檢出量呈正相關,這表明羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中SEM的生成與其攝入的精氨酸含量相關,精氨酸能促進羅氏沼蝦體內(nèi)SEM的生成,樣品中精氨酸含量越高,其SEM檢出量越高。

圖6 精氨酸對羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出量的影響Fig.6 Effect of arginine on endogenous SEM detection of Macrobrachium rosenbergii注:大寫不同字母表示不同含量的精氨酸對羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出差異顯著(P<0.05);小寫不同字母表示養(yǎng)殖時間對羅氏沼蝦內(nèi)源SEM檢出差異顯著(P<0.05)。

A-羅氏沼蝦蝦殼,B-羅氏沼蝦蝦肉圖7 不同生長期羅氏沼蝦不同組織中SEM檢出量與精氨酸含量的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between SEM detection amount and arginine content in different tissues of M.rosenbergii in different growth stages

3 結(jié)論與討論

本實驗通過對不同處理方式下的羅氏沼蝦的蝦殼和蝦肉中的SEM進行檢測,得出隨著烘干溫度的升高,羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中的蛋白質(zhì)含量逐漸降低,而蝦殼和蝦肉中的SEM檢出量卻隨之升高,這說明烘干溫度對羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM的生成有促進作用,在對羅氏沼蝦等甲殼類水產(chǎn)品進行NFZ的檢測時,應盡可能避免蝦殼等甲殼物質(zhì)混入其中,同時避免檢測溫度高于50 ℃。通過對羅氏沼蝦蝦殼和蝦肉中氨基酸的分析,本實驗通過室內(nèi)人工喂養(yǎng)精氨酸混合飼料的方式探索羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM生成的可能影響因素。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著養(yǎng)殖時間的延長,羅氏沼蝦蝦殼內(nèi)的SEM呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,蝦肉中的SEM檢出量無明顯變化趨勢。攝入不同含量精氨酸的羅氏沼蝦,蝦殼和蝦肉SEM檢出量分別存在顯著性差異 (P<0.05),這說明精氨酸能夠促進羅氏沼蝦內(nèi)源性SEM的生成。