吳玲姣，鄧潔，徐瑤，彭聰，徐蕾

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦科，四川 成都 610500）

宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第四大原因，是目前影響全球女性健康的重要難題[1]。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，全球每年約50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，我國(guó)每年宮頸癌新發(fā)病例約12萬(wàn)，其中4.8萬(wàn)患者死于宮頸癌[2]。外科手術(shù)切除、輔助放化療等綜合治療是目前臨床治療宮頸癌的常用手段。國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)化療可顯著改善宮頸癌患者臨床療效，使患者獲得生存收益，但長(zhǎng)期使用化療藥物可引起宮頸癌患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，降低藥物效價(jià)，最終導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病情進(jìn)展，影響患者預(yù)后[3-4]。如何有效抑制化療藥物耐藥已成為宮頸癌治療的關(guān)鍵，深入探討宮頸癌患者化療耐藥機(jī)制對(duì)于尋找宮頸癌治療新手段具有重要意義。

近期研究發(fā)現(xiàn)化療藥物耐藥性與microRNA（miRNA）調(diào)控的不同耐藥基因表達(dá)的變化密切相關(guān)[5]。miRNA是一類小的非編碼RNA，由19～29個(gè)核苷酸組成，通過(guò)堿基配對(duì)與靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)逃避及化療抗性等過(guò)程[6]。在宮頸癌中，已證實(shí)microRNA-218（miR-218）可作為腫瘤抑制因子調(diào)節(jié)與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)程[7]；microRNA-193b（miR-193b）與腫瘤患者抗腫瘤藥物順鉑敏感性密切相關(guān)[8]。目前關(guān)于miR-218、miR-193b在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與化療耐藥性的關(guān)系尚缺乏報(bào)道，本研究探討上述問(wèn)題，以期為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2023年1月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的101例行手術(shù)治療的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《子宮頸癌診斷與治療指南（2021年版）》[9]中宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次確診且行宮頸癌手術(shù)，術(shù)后行化療；③年齡> 18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷；②重要臟器功能障礙；③伴其他部位惡性腫瘤；④醫(yī)患溝通障礙；⑤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，伴性病、陰道炎等疾??；⑥術(shù)前血栓高度風(fēng)險(xiǎn)、術(shù)前行放化療；⑦既往有子宮頸手術(shù)史；⑧伴手術(shù)禁忌證；⑨依從性差、自然失訪。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)及取材 參照《子宮頸癌診斷與治療指南（2021年版）》[9]，患者行手術(shù)治療（包括保留生育功能手術(shù)、不保留生育功能手術(shù)、盆腔廓清術(shù)、腹主動(dòng)脈±平羌淋巴結(jié)切除分期手術(shù)），切除原發(fā)病灶，術(shù)后行病理檢查確認(rèn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，并給予化療。將距腫瘤組織> 2 cm的組織作為癌旁組織。

1.2.2 癌組織化療耐藥性測(cè)定 將一部分癌組織標(biāo)本消化制成細(xì)胞懸液后行化療藥物敏感性測(cè)定，將腫瘤組織剪成糊狀碎塊，消化酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL；取單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板（180 μL/孔）中，分別加入藥物終濃度為血漿峰值濃度的紫杉醇（58 mg/L）、順鉑（102 mg/L）、阿霉素（64 mg/L）、5-氟尿嘧啶（82 mg/L）、卡鉑（43 mg/L），設(shè)5種測(cè)試濃度（測(cè)試藥物的0.125、0.250、0.500、1.000、2.000倍），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。標(biāo)本在37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，添加10μL 噻唑藍(lán)（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100μL鹽酸異丙醇（0.04 N），靜置10 min，用多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)，計(jì)算平均值。腫瘤細(xì)胞抑制率=[1-（X-Mi）/（Mo-Mi）]×100%（X、Mo、Mi為熒光強(qiáng)度抑制率），計(jì)算出殺傷50%腫瘤細(xì)胞所需藥物濃度（IC50）和IC90，將IC90 > 100%測(cè)試藥物濃度、IC50 > 25%測(cè)試藥物濃度記為耐藥。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)癌組織、癌旁組織miR-218、miR-193b表達(dá) 宮頸癌組織和癌旁組織在液氮中研碎，勻漿后使用QIACEN RNeasy Mini試劑盒（日本TaKaRa株式會(huì)社）分別提取癌及癌旁組織總RNA，分離miRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，93 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，60 ℃拉伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參U6，繪制熔解曲線，CT值為基礎(chǔ)，2-ΔΔCT法計(jì)算miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較

癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，miR-193b相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織。見(jiàn)表2。

表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較 （n =101，±s）

表2 癌組織、癌旁組織中miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較 （n =101，±s）

組織癌旁組織癌組織t 值P 值miR-218 8.04±1.23 3.82±0.47 20.294 0.000 miR-193b 0.47±0.09 2.01±0.38 38.127 0.000

2.2 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況比較

宮頸癌患者對(duì)體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%（39/101）、46.53%（47/101）、48.51%（49/101）、26.73%（27/101）、40.59%（41/101）。宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者對(duì)體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑耐藥率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 宮頸鱗癌與宮頸腺癌患者常用化療藥物耐藥情況 例（%）

2.3 不同耐藥宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），耐藥患者癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)量均低于敏感患者，miR-193b相對(duì)表達(dá)量均高于敏感患者。見(jiàn)表4。

表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 不同耐藥情況的宮頸癌患者癌組織miR-218、miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

藥物n t 值P 值t 值P 值紫杉醇2.456 0.016 3.002 0.003順鉑4.281 0.000 2.955 0.004阿霉素2.145 0.034 2.559 0.012 5-氟尿嘧啶2.309 0.023 2.278 0.025卡鉑耐藥情況耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感耐藥敏感39 62 47 54 49 52 27 74 41 60 miR-218 3.67±0.52 3.91±0.45 3.58±0.57 4.02±0.46 3.69±0.63 3.94±0.54 3.63±0.53 3.89±0.49 3.55±0.58 3.99±0.64 3.523 0.001 miR-193b 2.13±0.35 1.93±0.31 2.09±0.28 1.94±0.23 2.07±0.26 1.95±0.21 2.11±0.33 1.97±0.25 2.16±0.32 1.91±0.22 4.656 0.000

2.4 癌組織miR-218、miR-193b預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性的價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-218、miR-193b及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性分別為74.51%（95% CI：0.601，0.852）、70.59%（95% CI：0.560，0.821）、82.35%（95% CI：0.686，0.911），特異性分別為74.00%（95% CI：0.594，0.849）、78.00%（95%CI：0.637，0.880）、90.00%（95% CI：0.774，0.963），曲線下面積分別為0.754（95% CI：0.661，0.847）、0.743（95% CI：0.643，0.843）、0.890（95% CI：0.824，0.956）。見(jiàn)圖1和表5。

圖1 癌組織中miR-218、miR-193b表達(dá)預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性的ROC曲線

表5 癌組織中miR-218、miR-193b表達(dá)預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性的效能

3 討論

宮頸癌的一線化療藥物多為鉑類化合物、紫杉烷類等，順鉑的作用機(jī)制是基于鏈內(nèi)和鏈間DNA交聯(lián)的形成，順鉑可通過(guò)抑制DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，ABC家族的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常表達(dá)可造成順鉑回流增加，或有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致順鉑攝取減少，在細(xì)胞內(nèi)順鉑又可以被含巰基的分子滅活，致使癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低；紫杉醇可與β-微管蛋白亞基結(jié)合，從而穩(wěn)定微管并阻斷有絲分裂，細(xì)胞分裂受阻，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，紫杉醇耐藥性中最重要的因素為ABC家族的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá)；此外致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的豐富表達(dá)可限制化療藥物滲透到癌組織中；miRNA是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制，其耐藥機(jī)制的產(chǎn)生均與miRNA調(diào)節(jié)的耐藥基因表達(dá)改變有關(guān)[10]。宮頸癌中miRNA概況的體內(nèi)外研究也表明，與耐藥細(xì)胞系/組織相比，敏感細(xì)胞系/組織中miRNA的特征發(fā)生了明顯變化[11]。miRNA可通過(guò)堿基配對(duì)與靶基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)使靶基因降解或抑制靶基因翻譯，miRNA能夠通過(guò)識(shí)別目標(biāo)mRNA的3'-非翻譯區(qū)末端的非必要互補(bǔ)序列來(lái)與許多基因結(jié)合，控制基因表達(dá)并影響細(xì)胞代謝、增殖、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。miRNA作為腫瘤抑制因子或致癌基因，調(diào)節(jié)大量基因和信號(hào)通路，可用于預(yù)測(cè)宮頸癌患者對(duì)化療的反應(yīng)，是預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的合適生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，miR-193b相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，說(shuō)明miR-218、miR-193b表達(dá)與宮頸癌發(fā)生關(guān)系密切。miRNA在許多細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能中起著重要作用，在調(diào)節(jié)包括分化、血管生成和細(xì)胞周期在內(nèi)的多種信號(hào)通路和生物過(guò)程中起核心作用。因此miRNA表達(dá)的改變與包括癌癥在內(nèi)的大量疾病有關(guān)。在癌細(xì)胞中，miRNA可作為抑癌基因或致癌基因，抑癌miRNA可通過(guò)負(fù)調(diào)控癌基因的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展，且在癌細(xì)胞中表達(dá)降低；致癌基因在癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)抑癌基因的負(fù)調(diào)節(jié)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，101例宮頸癌患者行體外化療藥物紫杉醇、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡鉑的耐藥率分別為38.61%、46.53%、48.51%、26.73%和40.59%，提示宮頸癌患者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)較高。越來(lái)越多的證據(jù)指出，miRNA在包括宮頸癌、卵巢癌在內(nèi)的各種癌癥的耐藥性方面發(fā)揮著重要作用。耐藥患者癌組織中miR-218相對(duì)表達(dá)量低于敏感患者，miR-193b相對(duì)表達(dá)量高于敏感患者，提示miR-218、miR-193b表達(dá)與宮頸癌患者化療耐藥有關(guān)。miR-218作為一種抑癌基因，上調(diào)miR-218表達(dá)可通過(guò)靶向下調(diào)蛋白磷酸酶甲酯e1、cyclin E2/smc4、磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶1進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-218通過(guò)靶向Glut1k可增加膀胱癌對(duì)順鉑的敏感性[12]；miR-218-5p通過(guò)prkce/Mdr1軸調(diào)控膽囊癌對(duì)吉西他濱的敏感性[13]；miR-218通過(guò)調(diào)控ppp2r5a/Wnt信號(hào)通路促進(jìn)口腔癌順鉑耐藥[14]；miR-218-5p靶向EGln3抑制肺腺癌增殖、遷移和侵襲[15]。筆者推測(cè)miR-218可能通過(guò)多種信號(hào)通路途徑調(diào)節(jié)宮頸癌患者基因和信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)化療藥物耐藥性。GRABOWSKA等[16]研究顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤中miR-218的減少影響細(xì)胞外基質(zhì)組成和細(xì)胞生物力特征，細(xì)胞外基質(zhì)及膠質(zhì)母腫瘤細(xì)胞剛性的變化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。CRUZ-de la ROSA等[11]研究顯示，miR-218-5p/Runx2軸正向調(diào)節(jié)增殖與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。吳雄健等[17]研究顯示，上調(diào)miR-218/Nedd9軸可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。王旭等[18]研究指出，miR-218-5p可靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A基因促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡并抑制遷移。李正雄等[19]研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA鐵蛋白重鏈1假基因3靶向miR-218促使其表達(dá)下調(diào)，可降低人肺癌順鉑耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。

Polo樣激酶1是細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，miR-193b-5p可通過(guò)靶向Polo 樣激酶1 mRNA的3'-端非編碼區(qū)，抑制Polo樣激酶1表達(dá)，miR-193b-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制Polo樣激酶1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，HapMap細(xì)胞系中，miR-193b過(guò)表達(dá)會(huì)增加卡鉑和順鉑的耐藥性[20]。Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在癌細(xì)胞獲得性化療耐藥性中起關(guān)鍵作用，髓樣細(xì)胞白血病-1是抗凋亡Bcl-2家族蛋白的重要成員，在預(yù)后不良的人類癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，miR-193b可通過(guò)下調(diào)髓樣細(xì)胞白血病-1來(lái)調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性[21]；筆者推測(cè)miR-193b可能通過(guò)調(diào)節(jié)宮頸癌患者基因和信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)化療藥物耐藥性，但具體作用機(jī)制仍需后期進(jìn)一步探討。陳晨晨等[22]研究指出，miR-193b的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)，且miR-193b可通過(guò)靶向于Mcl-1增強(qiáng)紫杉醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的殺傷效力。杜文霞等[23]研究指出，miR-193b在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，沉默miR-193b可增加HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，作用機(jī)制可能與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有關(guān)。miR-193b的表達(dá)與腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性有關(guān)[24]；外泌體miR-193b-3p通過(guò)靶向Zbtb7a促進(jìn)精原細(xì)胞瘤中的順鉑敏感性[8]。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-218聯(lián)合miR-193b預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性的敏感性、特異性、曲線下面積最高，提示miR-218聯(lián)合miR-193b預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-218表達(dá)低于癌旁組織、miR-193b表達(dá)高于癌旁組織，miR-218、miR-193b的表達(dá)水平與宮頸癌患者化療耐藥性有關(guān)，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)宮頸癌患者化療耐藥性效能良好。后期仍需更多臨床與基礎(chǔ)研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。