孫 超，王玉晶，朱立欣，黃艷麗，湯連升

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 新藥評價中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300012）

烏雞白鳳片起源于中藥經(jīng)典名方，屬于對傳統(tǒng)名方的二次劑型升級，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止帶功效，本品用于氣血兩虛、身體瘦弱、腰膝酸軟、月經(jīng)不調(diào)、帶下[1]。中藥因其成分復(fù)雜，給不良反應(yīng)監(jiān)控帶來諸多困難[2]。成年女性是烏雞白鳳片的常用人群，但關(guān)于烏雞白鳳片對于妊娠期女性胚胎及胎仔發(fā)育的影響鮮有報道，故開展其臨床前胚胎及胎仔發(fā)育的評價尤為重要。本文在GLP條件下，利用SPF級SD大鼠為實驗動物，經(jīng)妊娠期間重復(fù)給藥，對SD大鼠進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育毒性的評價研究，為該藥的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠（維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），飼養(yǎng)于山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價中心SPF級動物房，環(huán)境溫度 20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，濕度 40 %～70 %，動物自由飲食飲水。本實驗遵循實驗動物使用的3R原則，對動物給予人道主義關(guān)懷。

1.2 受試物和主要儀器

烏雞白鳳片（津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司樂仁堂制藥廠，批號：ZSWB210601）。

UW2200H電子天平（日本島津）；TXB622L電子天平（日本島津）；UlitiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo）；LED數(shù)顯加熱型磁力攪拌器（BIOLOGIX）；游標(biāo)卡尺（哈爾濱量具刃具集團(tuán)）。

1.3 試驗方法

1.3.1 劑量設(shè)計 根據(jù)藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則及相關(guān)文獻(xiàn)確定試驗劑量[3-6]。烏雞白鳳片臨床用法用量為每天給藥2次，一次2片，每片0.5 g[1]。按照成人平均體重70 kg折算用量為28.6 mg/(kg·d)，大鼠的等效臨床用量約為180 mg/(kg·d)。烏雞白鳳片最大可行性給藥濃度為500 mg/ml，大鼠重復(fù)灌胃給藥可接受最大體積為20 ml/kg。故本試驗供試品設(shè)計低、中、高劑量組給藥劑量分別為2.5，5.0和10.0 g/(kg·d)，分別約為人用臨床劑量的87.4，174.8和349.7倍，大鼠等效臨床劑量的13.9，27.8和55.6倍。同時設(shè)溶媒對照組（純水）作為對照。

1.3.2 動物分組 將檢疫合格的雌鼠與雄鼠l:l合籠交配，合籠后次日觀察陰道栓脫落情況，發(fā)現(xiàn)陰道栓者確認(rèn)為妊娠0天（GD0）[7]，將GD0雌鼠分組，未見陰道栓者繼續(xù)交配，以每天確認(rèn)受孕動物為基數(shù)采用普通拉丁法進(jìn)行分組。

1.3.3 給藥方法 將烏雞白鳳片粉碎至細(xì)粉后純水?dāng)嚢杌靹蛑了铦舛?，采用HPLC法測定配制后制劑內(nèi)芍藥苷含量[8-9]。模擬臨床給藥途徑采用經(jīng)口灌胃進(jìn)行給藥，每天給藥1次，給藥周期為GD6～GD17，供試品組給藥制劑在給藥前置常溫持續(xù)攪拌至混懸均勻，給藥過程中持續(xù)攪拌。

1.3.4 指標(biāo)檢查[10]孕鼠檢查：試驗期間，所有孕鼠每天進(jìn)行臨床觀察，定期進(jìn)行體重和攝食量檢測。孕鼠于GD20解剖觀察，測定卵巢和子宮窩重，剖開子宮，暴露著床痕，依據(jù)著床痕的位置按照從右側(cè)子宮角到左側(cè)子宮角的順序，以阿拉伯?dāng)?shù)字依次標(biāo)記活胎，并標(biāo)記吸收胎及死胎位置，計數(shù)黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和著床數(shù)。

胎仔檢查：活胎仔判斷性別，測定體長、尾長和體重，進(jìn)行外觀檢查。每窩取約半數(shù)活胎胎仔制作內(nèi)臟標(biāo)本；每窩剩余半數(shù)活胎胎仔制備成骨骼標(biāo)本；對標(biāo)本進(jìn)行內(nèi)臟和骨骼檢查。

1.3.5 統(tǒng)計指標(biāo)[11]孕鼠體重、攝食量、子宮（窩重）、卵巢濕重、胎仔窩平均體重、窩平均身長、窩平均尾長、黃體數(shù)、胎仔數(shù)（著床數(shù)）等數(shù)據(jù)采用單因素方差法進(jìn)行統(tǒng)計分析?；钐ヂ省⑺捞ヂ?、吸收胎率、外觀畸形率、內(nèi)臟畸形率、骨骼畸變率、骨骼變異率等指標(biāo)采用χ2檢驗。所有檢驗結(jié)果以雙側(cè)檢驗顯著性為準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕鼠檢查

試驗期間，各組孕鼠一般狀態(tài)良好，未見由于給藥引起的異常癥狀。試驗期間，給藥各組妊娠動物體重與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥組動物部分時期攝食量較溶媒對照組小幅降低，但體重均未見影響，認(rèn)為其主要原因為給藥體積較大和給藥制劑黏稠引起胃容量減少，導(dǎo)致的攝食量減少，屬于非毒性因素。剖檢各組孕鼠肉眼均未見明顯臟器組織的異常。供試品各給藥劑量組妊娠鼠子宮（窩重）和卵巢臟器濕重與溶媒對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1～3。

表1 烏雞白鳳片對孕鼠體重指標(biāo)的影響/g

表2 烏雞白鳳片對孕鼠攝食量指標(biāo)的影響/g

表3 烏雞白鳳片對孕鼠生殖器官濕重的影響/g

供試品各組孕鼠黃體數(shù)及胎仔數(shù)（著床數(shù)）與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。供試品各給藥劑量組活胎率和死胎率與溶媒對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），供試品中、高劑量組動物吸收胎率與溶媒對照組比較降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），吸收胎率降低對生殖發(fā)育是有益的，提示SD大鼠妊娠期間給予供試品可能具有一定的保胎作用，其作用體機(jī)制待進(jìn)一步研究。詳見表4。

表4 孕鼠生殖功能指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果

2.2 胎仔檢查

供試品各給藥組胎仔體重、身長和尾長與溶媒對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 胎仔發(fā)育和胎仔外觀檢查指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果

溶媒對照組和供試品低、中劑量組胎仔外觀檢查均發(fā)現(xiàn)個別胎仔身體局部血腫或水腫現(xiàn)象，供試品高劑量組胎仔外觀檢查均未見異常。由于上述外觀異常散在分布且出現(xiàn)的部位各不先相同，且無劑量相關(guān)性，判斷為剖宮取胎仔過程中使用工器具物理損傷造成，與供試品無關(guān)。詳見表5。

溶媒對照組胎仔內(nèi)臟檢查未見異常，供試品高劑量組有1例胎仔為小型大腦，其它均未見異常，供試品高劑量組胎仔內(nèi)臟畸形率與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且畸形率很低，考慮為自發(fā)性畸形，故未進(jìn)行供試品低、中劑量組胎仔的內(nèi)臟畸形檢查，提示妊娠大鼠連續(xù)給予供試品未見對胎仔內(nèi)臟發(fā)育各檢查指標(biāo)的影響。詳見表6。

表6 胎仔內(nèi)臟和骨骼檢查統(tǒng)計結(jié)果

溶媒對照組和供試品高劑量組胎仔骨骼檢查主要異常為骨化不全和未骨化。骨化不全發(fā)生部位主要是顱骨背部上枕骨和胸骨，供試品高劑量組骨化不全變異率與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），溶媒對照組和供試品高劑量組未骨化出現(xiàn)窩數(shù)分別為19/22，16/21，散在分布于各檢查窩。未骨化發(fā)生部位主要為胸骨，供試品高劑量組未骨化畸形率與溶媒對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），溶媒對照組和供試品高劑量組未骨化出現(xiàn)窩數(shù)分別為15/22，12/21，散在分布于各檢查窩。骨骼變異的骨化不全及畸形的未骨化異常，均可隨胎仔出生后逐步恢復(fù)。提示妊娠大鼠連續(xù)給予供試品未見對胎仔骨骼發(fā)育各檢查指標(biāo)的影響。詳見表6。

3 結(jié)論

本試驗條件下，妊娠鼠于GD6～GD17日經(jīng)口灌胃給予10 g/(kg·d)及以下劑量的烏雞白鳳片，對妊娠SD大鼠母體和胚胎未見毒性影響，胎仔發(fā)育正常，無致畸作用，妊娠SD大鼠母體NOAEL和胎仔NOAEL均為10 g/(kg·d)。烏雞白鳳片用于成年女性主要治療子宮出血、月經(jīng)不調(diào)、乳腺增生、高催乳素等癥狀[12-15]，對于妊娠期婦女，本品臨床使用安全范圍較大，安全窗較寬，是否有明顯胎兒致畸風(fēng)險還需更多臨床驗證。