劉 麗，王建成，韓慶霞，王 亮，王 娜

（臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276001）

大黃蟄蟲丸源于漢代醫(yī)圣張仲景編著的《金匱要略》，收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部[1]，主要由熟大黃、干漆（煅）、桃仁、炒苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草、土鱉蟲（炒）、水蛭（制）、虻蟲（去翅足，炒）、蠐螬（炒）等十二味中藥組成，同時(shí)含有植物藥和動(dòng)物藥；具有活血破瘀、通經(jīng)消癥的功能，用于瘀血內(nèi)停所致的癥瘕、閉經(jīng)，癥見腹部腫塊、肌膚甲錯(cuò)、面色黯黑、潮熱羸瘦、經(jīng)閉不行[1]，可用于慢性肝炎、肝纖維化和腫瘤的輔助治療等[2-9]?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部中對(duì)大黃蟄蟲丸含量的測(cè)定僅包括大黃素和大黃酚[1]，缺乏對(duì)其他有效成分含量的控制。大黃蟄蟲丸藥效需要復(fù)方協(xié)同發(fā)揮作用，多成分全面質(zhì)量控制具有重要意義，由于其他動(dòng)物藥目前缺乏明晰的有效成分指標(biāo)，因此，本文參考《中國(guó)藥典》中桃仁、苦杏仁、黃芩、白芍等質(zhì)量控制指標(biāo)，選取黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的含量對(duì)大黃蟄蟲丸進(jìn)行質(zhì)量控制。

目前，已報(bào)道的大黃蟄蟲丸成分測(cè)定主要方法有高效液相色譜法（HPLC）[1,10-13]，但多種成分同時(shí)測(cè)定的方法較少。HPLC在測(cè)定中需要對(duì)每個(gè)化合物的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行掃描獲取，同時(shí)在多組分測(cè)定中需要切換波長(zhǎng)；與質(zhì)譜檢測(cè)器相比，紫外檢測(cè)器靈敏度較低，對(duì)液相色譜分離技術(shù)也提出更高要求。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS），以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)，樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖；具有高靈敏度、對(duì)色譜分離要求相對(duì)簡(jiǎn)單、多成分同時(shí)測(cè)定、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)。為了保證測(cè)定的靈敏度，UPLC-MS/MS只需特定的離子對(duì)即可[14]。UPLC-MS/MS廣泛用于生化分析、藥代動(dòng)力學(xué)、食品安全、化妝品和保健食品分析和環(huán)境污染物分析等領(lǐng)域[15-22]。本文采用UPLC-MS/MS，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）和正負(fù)離子同時(shí)采集方式，在一個(gè)分析周期內(nèi)完成對(duì)樣品溶液中黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的掃描，得到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和準(zhǔn)確碎片離子信息。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Exion LC AD/Triple Quad 4500超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)SCIEX公司），配備有ESI源，Exion LC AD超高效液相色譜儀配備高壓二元泵（最大耐壓100 MPa）、自動(dòng)進(jìn)樣器（溫控）、柱溫箱（溫控）、在線控制器。Analyst Software 3.2軟件，用于儀器控制、設(shè)置化合物參數(shù)、數(shù)據(jù)采集。SCIEX OS軟件用于數(shù)據(jù)處理。KQ-300 GDV溫控超聲儀（昆山市超聲儀器公司）。Mettler XP 205電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：111595-201808，含量以97.9 %計(jì)）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201821，含量以95.4 %計(jì)）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201808，含量以88.2 %計(jì)）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201922，含量以99.4 %計(jì)）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201817，含量以99.2 %計(jì)）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201908，含量以95.0 %計(jì)）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202044，含量以96.8 %計(jì)）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201914，含量以95.2 %計(jì)）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-202021，含量以96.2 %計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈為色譜純（美國(guó)默克試劑公司）；甲酸為色譜純（上海阿拉丁）；水為超純水（Milipore超純水機(jī)）；其他試劑均為分析純。5批不同廠家生產(chǎn)大黃蟄蟲丸（市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Technologies Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %甲酸水溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，70 % B；2～12 min，10 % B；12～15 min，70 % B）；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：15 ℃；柱溫：40 ℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 Triple Quad 4500質(zhì)譜系統(tǒng)配有Turbo V ESI源，采用MRM和正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，電子噴霧電壓為+5500 V/-4500 V，離子源溫度為500 ℃，氣簾氣使用氮?dú)猓魉贋?5.0 psi，碰撞氣使用氮?dú)?，流速?.0 psi，噴霧氣使用空氣，流速為55.0 psi，輔助加熱氣為空氣，流速為55.0 psi。使用SCIEX質(zhì)譜專用校正液進(jìn)行PPG質(zhì)量準(zhǔn)確度校準(zhǔn)一次質(zhì)量軸。使用Q1 Scan方式確定化合物母離子的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后一位，母離子掃描范圍為50.0～1300.0 m/z，針泵恒流進(jìn)樣流速設(shè)為10.000 μl/min，持續(xù)時(shí)間（Duration）設(shè)為5.00 min，正負(fù)模式分開掃描。使用Product Ion Scan（MS2）確定子離子的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后一位，Product Of設(shè)為母離子質(zhì)荷比，定持續(xù)時(shí)間（Duration）為2.00 min，設(shè)定碰撞電壓（CE）初始值為5 eV，可按需求以5 eV為步長(zhǎng)手動(dòng)調(diào)節(jié)，母離子的強(qiáng)度為圖譜中基峰強(qiáng)度的1/3到1/4為宜，待儀器穩(wěn)定后選擇至少2～3個(gè)子離子。使用MRM優(yōu)化化合物參數(shù)，駐留時(shí)間（Dwell Time）設(shè)為100 ms，用“Ramp”優(yōu)化碰撞能量（Collision Energy）和去簇電壓（Declustering Potential），連續(xù)優(yōu)化2次，以得到較確切結(jié)果。黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種化合物的保留時(shí)間、準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片離子信息、去簇電壓、碰撞能量見表1?；旌蠈?duì)照品溶液和供試品溶液總離子流圖譜見圖1。

表1 9種成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的總離子流圖

2.2 溶液配制

2.2.1 系列濃度混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨對(duì)照品各約10 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液（約0.2 mg/ml）；再分別精密吸取上述貯備液適量，加甲醇溶液逐步稀釋得到0.04，0.08，0.10，0.20，0.40，0.80，1.0 μg/ml的系列濃度混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取供試品，研細(xì)后，精密稱取細(xì)粉約3.0 g，置入50 ml量瓶，加甲醇約30 ml，超聲30 min（功率160 W，頻率40 kHz），放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 ml，置入100 ml量瓶，用10 %甲醇-水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，各成分離子對(duì)和溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取系列混合對(duì)照品溶液各5 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積；以待測(cè)成分質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 9種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.3.3 檢測(cè)限和定量限 將混合對(duì)照品溶液稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3:1為檢出限和10:1為定量限，計(jì)算得黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的檢出限分別為0.1，0.1，0.2，0.1，0.1，0.2，0.1，0.2，0.2 ng/ml，定量限均為0.5 ng/ml。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液0.2 μg/ml續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的峰面積的RSD分別為1.53 %，1.27 %，1.60 %，1.09 %，1.46 %，1.38 %，1.17 %，1.84 %，1.03 %，均小于2.0 %，表明精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批號(hào)大黃蟄蟲丸樣品6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，分別計(jì)算得黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨在6份樣品中的含量的RSD分別為1.37 %，1.62 %，1.24 %，1.68 %，1.25 %，2.02 %，1.63 %，1.78 %，2.11 %，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.5項(xiàng)下同一供試品溶液（4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?，分別于0，2，4，8，16，24，48 h分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的峰面積的RSD分別為1.52 %，1.14 %，1.73 %，1.01 %，1.62 %，1.84 %，1.33 %，2.20 %，1.42 %，均小于3.0 %，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一混合對(duì)照品溶液（4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?，分別于0，2，4，8，16，24，48 h分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分峰面積的RSD分別為1.37 %，1.08 %，1.55 %，1.02 %，1.57 %，1.68 %，1.21 %，1.89 %，1.33 %，均小于3.0 %，表明對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 取黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含黃芩素75 μg、黃芩苷135 μg、苦杏仁苷170 μg、大黃酚400 μg、大黃素甲醚300 μg、甘草苷35 μg、芍藥苷200 μg、毛蕊花糖苷30 μg、甘草酸銨20 μg的混合溶液，作為待加混合對(duì)照品溶液。取已測(cè)定黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分含量的樣品6份，各約1.5 g，精密稱定，分別精密加入上述待加混合對(duì)照品溶液1 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 （續(xù)）

2.4 樣品測(cè)定

取5批大黃蟄蟲丸樣品，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 9種成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

大黃蟄蟲丸處方中含12味藥材，所含中藥味較多，采用HPLC法檢測(cè)時(shí)色譜峰干擾較多，方法靈敏度低，不能同時(shí)滿足定性定量的需求。UPLCMS/MS具有高效快速的分離能力、超高的靈敏度和準(zhǔn)確度、高選擇性的特點(diǎn)，可在一針15 min內(nèi)同時(shí)完成黃芩素、黃芩苷、大黃素甲醚、大黃酚、芍藥苷、苦杏仁苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、甘草酸銨等9種成分的定量測(cè)定和定性分析。

3.2 提取方法和提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)考察了超聲提取、回流提取、甲醇-水（2:8）、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、乙腈、甲醇溶液的提取效果。結(jié)果表明，提取效率、峰的分離度和峰形差別明顯，超聲提取和甲醇提取的效果最好，因此選用超聲提取和甲醇作為提取溶劑。測(cè)定時(shí)純甲醇溶劑對(duì)峰形有影響，加入水溶液后，峰形和響應(yīng)值得到明顯改善。因此，最終確定用甲醇提取，并用10 %甲醇-水溶液稀釋定容。

3.3 質(zhì)譜掃描模式的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用MRM掃描模式，采用正負(fù)離子同時(shí)采集的方式，在一個(gè)分析周期內(nèi)完成對(duì)樣品溶液中黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分的掃描，得到準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和準(zhǔn)確碎片離子信息，在完成定量分析的基礎(chǔ)上還能同時(shí)得到化合物二級(jí)準(zhǔn)確子離子信息，可作為定性分析的依據(jù)。

3.4 測(cè)定結(jié)果分析

5批樣品中黃芩素、黃芩苷、苦杏仁苷、大黃酚、大黃素甲醚、甘草苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、甘草酸銨等9種成分均有檢出，但含量差別顯著，目前，中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多采用控制某一成分的含量，并不能完全完整反映中成藥的有效成分狀況。因此，應(yīng)盡量對(duì)多種有效成分同時(shí)測(cè)定，獲得中藥有效成分多維信息，使不同的企業(yè)間、同一企業(yè)的不同批次間的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，有效準(zhǔn)確控制中藥質(zhì)量，確保療效的穩(wěn)定、可控。