張連義，郭常川，陳 真，李文馨，楊書娟，竇艷麗，王 雪，李 琳，徐玉文

（山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101）

氟比洛芬酯注射液是一種非甾體類抗炎藥（NSAIDS）[1]，用于治療術(shù)后疼痛和癌痛[2]。其成分較復(fù)雜，含有大豆油（供注射用）、甘油（供注射用）、蛋黃卵磷脂等。

因藥品中可能含有的元素雜質(zhì)不能提供任何治療效果，所以雜質(zhì)含量需被控制在可接受的限度范圍內(nèi)。元素雜質(zhì)的來源有在合成中添加的催化劑殘留，也可能是通過與生產(chǎn)設(shè)備或容器密閉系統(tǒng)相互作用產(chǎn)生或存在于藥品的各個組分中[3-4]。按照藥品的給藥途徑及其與包裝材料發(fā)生相互作用的可能性分級，注射劑等制劑被列為可能與包裝材料發(fā)生相互作用的高風(fēng)險制劑。

原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《藥用玻璃砷、銻、鉛、鎘浸出量限度》（YBB00172005-2015）[5]和《砷、銻、鉛、鎘浸出量測定法》（YBB00372004-2015）[6]規(guī)定檢測和評價的對象只有砷（As）、銻（Sb）、鉛（Pb）和鎘（Cd）等4種元素，其中As、Sb浸出量采用紫外分光光度法，Pb、Cd元素浸出量采用原子吸收分光光度法，方法中需化學(xué)反應(yīng)、萃取等前處理步驟，且靈敏度低，不能同時測定多種元素。電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）具有檢測限低，動態(tài)線性范圍寬，分析速度快，可同時測定多種元素等優(yōu)點[7]。有文獻報道中采用ICP-MS法測定藥用玻璃容器中金屬元素的浸出量[8]，只考慮浸出量，未檢測藥液在長期存放過程中遷移情況。有文獻采用ICP-MS測定脂肪乳注射液及包材中元素含量[9]，需對樣品消化處理，前處理步驟繁瑣、耗時長。有文獻方法學(xué)驗證中準(zhǔn)確度回收率偏低，且精密度不足[10]。本文參考《中國藥典》（2020年版）附錄通則9621藥包材通用技術(shù)指導(dǎo)原則和ICH指導(dǎo)原則Q3D（R2）元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則[11]，采用ICPMS，并經(jīng)方法學(xué)驗證，建立氟比洛芬酯注射液中的金屬元素雜質(zhì)測定的有效方法，對類似組成的注射劑同樣具有參考價值。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

PE NexLON2000電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀（珀金埃爾默），CP225D型十萬分之一電子天平（梅特勒公司），Q-POD ElementMilli-Q超純水機（默克密理博）。

1.2 試劑

超純水（自制），優(yōu)級純硝酸（江蘇晶瑞），無水乙醇（天津康科德）。

1.3 元素對照品

元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：鎘（Cd，M2-CD659870）、鉛（Pb，M2-PB655591）、砷（As，K2-AS654224）、汞（H g，M 2-H G 6 5 9 9 2）、鈷（C o，K 2-CO02072）、釩（V，K2-V02108）、鎳（Ni，M2-NI660480）、銻（Sb，K2-SB650297）、鍺（Ge，K2-GE01122AA）、銦（In，K2-IN01118）、鉍（Bi，N2-BI666938），購于美國Inorganic Ventures公司；鋰（Li，184047-2）、銅（Cu，185025-3），購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；金（Au，166660-73），購于上海安譜科技股份有限公司；以上元素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為1000 μg/ml。

1.4 試驗樣品

取2022年國家藥品抽檢樣品，a企業(yè)41批、b企業(yè)32批，共計73批，中硼硅玻璃安瓿瓶。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器參數(shù)

ICP-MS工作參數(shù)見表1。

表1 ICP-MS工作參數(shù)

2.2 測定方法

采用內(nèi)標(biāo)法，待測元素同位素選擇分別為111Cd、208Pb、75As、202Hg、59Co、51V、60Ni、7Li、121Sb、63Cu，其中111Cd、121Sb以115In為內(nèi)標(biāo)元素，202Hg、208Pb以209Bi元素為內(nèi)標(biāo)元素，其他元素以74Ge為內(nèi)標(biāo)元素。Au起穩(wěn)定Hg元素的作用，不做測定。分別依次測定標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品空白溶液、供試品溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各元素的浸出量。

2.3 溶液制備

混合對照儲備溶液的制備：分別精密量取Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Li、Sb和Cu元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用1 %硝酸溶液稀釋制成每1 ml分別含有Cd 0.068 μg，Pb 0.2 μg，As 0.6 μg，Hg 0.12 μg，Co 0.2 μg，V 0.4 μg，Ni 0.8 μg，Li 4 μg，Sb 3.6 μg，Cu 4 μg的混合儲備溶液，搖勻，即得。

Au元素儲備溶液的制備：精密量取Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用1 %硝酸溶液稀釋制成每1 ml中含Au 12 μg的溶液，搖勻，即得。

元素標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備：分別精密量取混合對照儲備溶液125，250，500，750，1000 μl，置入50 ml量瓶，分別加入Au元素儲備溶液0.5 ml，用1 %硝酸溶液稀釋定容至刻度，搖勻，即得。各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度見表2。

表2 各元素雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度/μg·L-1

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：分別精密量取Ge、In、Bi元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用1 %硝酸溶液稀釋制成含Ge、In、Bi元素各80 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

供試品溶液制備：精密量取本品0.1 ml，精密加入無水乙醇10 ml，精密加入Au元素儲備溶液0.5 ml，用1 %硝酸溶液稀釋并定容至50 ml聚四氟乙烯量瓶，搖勻。同法制備空白溶液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系 以分析元素的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，其對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。結(jié)果表明在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.999。結(jié)果見表3。

表3 線性試驗結(jié)果及檢測限、定量限

2.4.2 檢測限、定量限 連續(xù)測定空白溶液11次，取3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)濃度值作為檢出限；取10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)濃度值作為定量限。結(jié)果見表3。

2.4.3 精密度 取標(biāo)準(zhǔn)曲線S3溶液作為系統(tǒng)精密度溶液，連續(xù)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。結(jié)果表明，RSD≤4.2 %，方法精密度良好。結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗數(shù)據(jù)

2.4.4 重復(fù)性試驗和準(zhǔn)確度 精密量取本品0.1 ml，精密加入無水乙醇10 ml，精密加入Au元素儲備溶液0.5 ml，混合對照儲備溶液0.5 ml，用1 %硝酸溶液稀釋并定容至50 ml聚四氟乙烯容量瓶中，搖勻；同法制備6份，計算回收率RSD值。各元素6份樣品回收率RSD≤5.5 %，平均回收率范圍在94.39 %～107.82 %，表明方法重復(fù)性和回收率結(jié)果良好。結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.5 樣品測定

取73批樣品，按2.3項下制備供試品溶液，進樣測定，計算供試品溶液中元素雜質(zhì)含量。各待測元素的檢測量若小于檢出限，視為未檢出。a企業(yè)和b企業(yè)樣品中均未檢出Cd、Hg、Li、Sb和Cu 5種元素，占總待測元素的50 %；檢出Pb、As、Co、Ni和V 5種元素，Ni檢出量較大，其次是As、Pb、V和Co。各元素雜質(zhì)檢測結(jié)果統(tǒng)計分析箱線圖見圖1。

圖1 元素雜質(zhì)檢測結(jié)果統(tǒng)計分析箱線圖

2.6 檢出元素分析

2.6.1 1類元素檢出分析 Pb、As兩種元素檢出，檢出量分布圖見圖2。a企業(yè)有5批次樣品檢出Pb，檢出量分布在兩家企業(yè)的Pb檢出量均值均為9.3 μg /L，但b企業(yè)離散度更低，批次間Pb檢出量差異較小，而a企業(yè)批次間Pb檢出量波動較大。a企業(yè)有23批次檢出As，占a企業(yè)樣品的56 %，檢出量分布較為均勻，以18.5 μg /L為中心呈正態(tài)分布；b企業(yè)有31批次檢出As，占b企業(yè)樣品的97 %，僅有1批未檢出。檢出量分布較為集中，30批均在15 μg/L以內(nèi)。由檢出批次可見，b企業(yè)As檢出量均值、25 %～75 %分位數(shù)、1.5IQR范圍均明顯低于a企業(yè)，表明b企業(yè)對樣品中As的控制優(yōu)于a企業(yè)。

圖2 樣品中1類元素Pb、As檢出量分布圖

2.6.2 2A類元素檢出分析 Co、V、Ni均檢出，檢出量分布圖見圖3。a企業(yè)Co元素檢出25批次，占a企業(yè)樣品的61 %，檢出量較低，多數(shù)分布在0.6～1.2 μg/L之內(nèi)；b企業(yè)僅有5批次檢出Co元素，檢出量分布在0.5～3.5 μg/L之間。兩家企業(yè)Co元素檢出量的均值、25 %～75 %分位數(shù)相差不大，但a企業(yè)Co元素檢出批次數(shù)遠多于b企業(yè)。

圖3 樣品中2A類元素Co、V、Ni檢出量分布圖

a企業(yè)所有批次樣品中均有V元素檢出，檢出量分布較均勻，以6.5 μg/L為中心呈正態(tài)分布；b企業(yè)所有批次樣品中均有V元素檢出，檢出量分布也比較均勻，以4.6 μg/L為中心呈正態(tài)分布。a企業(yè)V元素檢出量的均值、中位數(shù)均明顯高于b企業(yè)，表明b企業(yè)對V元素雜質(zhì)的控制優(yōu)于a企業(yè)。

a企業(yè)Ni元素檢出9批次，占a企業(yè)樣品的22 %，檢出量差異很大，最小值為9.054 μg/L，最大值高達92.891 μg/L；b企業(yè)Ni元素檢出5批次，占b企業(yè)樣品的16 %，檢出量分布波動很大，有4批次樣品Ni檢出量在20～60 μg/L范圍內(nèi)，但有一批異常值高達137.451 μg/L。兩家企業(yè)對Ni元素的控制均不理想，既有大批量樣品未檢出，又有個別樣品檢出量高于100 μg/L，批次間波動巨大。

2.6.3 檢出最大值與分析評價閾值（AET）比較 根據(jù)指導(dǎo)原則中注射途徑每日允許暴露量（permitted daily exposure，PDE），計算得到各待測元素的分析評價閾值（analytical evaluation threshold，AET）。根據(jù)人每日允許最大暴露量或安全性閾值/限定閾值、用藥劑量和制劑包裝特點等，計算每個包裝容器中特定的可提取物和/或浸出物含量。計算公式：AET=PDE/日用最大劑量，本品日用最大劑量為5 ml（即0.005 L）。

取各元素的檢出量的最大值與AET值比較，結(jié)果見表6。兩家企業(yè)各元素雜質(zhì)檢出量最大值均遠低于AET閾值，表明a企業(yè)和b企業(yè)生產(chǎn)的氟比洛芬酯注射液中元素雜質(zhì)的含量符合指導(dǎo)原則的要求。

表6 待測元素及其限度值及檢出量最大值匯總表

3 討論

3.1 待測元素選擇

參考ICH Q3D（R2）元素雜質(zhì)控制指南，確定需考慮的10種無機元素為Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Li、Sb、Cu。其中，Cd、Pb、As、Hg屬于1類元素雜質(zhì)，為人體毒素，在藥品生產(chǎn)中應(yīng)禁用或限制使用；Co、V、Ni屬于2A類元素雜質(zhì)，是給藥途徑依賴型的人體毒素，出現(xiàn)在藥品中的相對可能性較高；Sb、Li、Cu屬于3類元素雜質(zhì)，此類元素口服給藥途徑的毒性相對較低，但在吸入和注射給藥途徑中的風(fēng)險評估中仍需考慮。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為消除或減少質(zhì)譜干擾，使用調(diào)諧液對儀器進行調(diào)諧，優(yōu)化儀器RF功率、氣體流速，降低氧化物離子干擾和雙電荷離子干擾。選擇合適的同位素進行測定，以豐度大、靈敏度高、同量異位素和多原子分子離子干擾少為選擇原則，試驗中元素同位素選擇分別為7Li、51V、59Co、60Ni、63Cu、74Ge、75As、111Cd、115In、121Sb、202Hg、208Pb、209Bi。

3.3 基體效應(yīng)消除

本試驗采用內(nèi)標(biāo)法消除基體效應(yīng)。由于待測元素質(zhì)量數(shù)范圍較寬，因此選擇了多個內(nèi)標(biāo)元素，按照內(nèi)標(biāo)同位質(zhì)量數(shù)與待測元素質(zhì)量數(shù)相近的原則，111Cd、121Sb以115In為內(nèi)標(biāo)元素，202Hg、208Pb以209Bi元素為內(nèi)標(biāo)元素，其他元素以74Ge為內(nèi)標(biāo)元素。用內(nèi)標(biāo)法定量，補償了基體效應(yīng)，并能有效地校正分析信號的漂移，保證測量的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本文根據(jù)ICH指導(dǎo)原則Q3D（R2），研究確定了氟比洛芬酯注射液中需要進行控制的無機元素雜質(zhì)種類。采用ICP-MS法，建立內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行方法學(xué)驗證，檢測樣品中無機元素雜質(zhì)含量，用以評價國家藥品抽檢樣品。對比兩家企業(yè)中檢出無機元素雜質(zhì)含量，對企業(yè)在生產(chǎn)工藝、原輔料控制、包材選擇中提供一定的參考意義。

本文對氟比洛芬酯注射液中無機元素含量進行了檢測，但未對長期試驗、加速試驗、影響因素試驗條件下制劑中元素含量情況進行測定，以考察中硼硅玻璃安瓿瓶中元素雜質(zhì)的遷移情況，這在未來工作中做進一步研究。