繆文玉，程繼安，陳 超，張娜郡，秦 楠 *

（1. 太原城市職業(yè)技術學院管理工程系，山西 太原 030027；2. 內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司奶粉事業(yè)部，湖北 宜昌 443000；3. 山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西 榆次 030619）

北芪菇是在平菇培養(yǎng)基中加入黃芪培育而成的一類新型食用菌類，產于山西省大同市渾源縣[1]。北芪菇既具有普通食用菌無脂肪、無膽固醇的特點，還具備黃芪的藥理作用，具有藥食同源價值[2]。近年，安全、高效的功能活性肽成為研究熱點[3]。來源于食源性蛋白質的抗氧化肽具有安全性高、活性高、功能性強等特點，能清除體內自由基，有效防止脂質氧化，并進一步延緩細胞衰老和死亡[4-8]。關于北芪菇的研究主要集中在成分研究及提取工藝[1-2,9-10]，基于北芪菇抗氧化功能制備抗氧化肽的研究較少。本文以北芪菇蛋白為原料，以復合蛋白酶[11]高效酶解蛋白，研究制備北芪菇蛋白抗氧化性多肽的最佳工藝條件，為北芪菇蛋白的深加工和抗氧化肽的深入研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試藥 北芪菇（渾源縣澤青芪業(yè)開發(fā)有限公司）；木瓜蛋白酶（6000 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（60 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、ABTS（北京索萊寶）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·，東京化成工業(yè)）；抗壞血酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀（天津科密歐）。

1.1.2 儀器 LXJ-IIB離心機（上海安亭科學儀器廠）；PHS-3C型pH計（上海盛磁）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇杰瑞爾）；Ultra-3660紫外可見分光光度計（北京普源精電）；AR223CN電子天平（奧豪斯儀器）。

1.2 方法

1.2.1 北芪菇蛋白肽的制備 北芪菇干粉按1:12加蒸餾水溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至8.0[12]，2700 r/min離心5 min，取上清加鹽酸調pH至4.5，5000 r/min離心15 min，取沉淀加蒸餾水配制為濃度為2 %的溶液，調節(jié)pH，加入蛋白酶，在最適溫度下酶解，反應完成后，95 ℃水浴滅酶15 min，5000 r/min離心15 min，取上清，得到北芪菇蛋白肽。

1.2.2 復合蛋白酶選擇

1.2.2.1 蛋白酶篩選 選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在最適溫度和pH值下進行酶解，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度[13]。

1.2.2.2 加酶方式選擇 選出兩種最佳蛋白酶后，根據(jù)表1的加酶方式進行酶解[14]，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度。

表1 加酶方式

1.2.2.3 加酶比例選擇 確定加酶方式后，分別按兩種酶比例1:1，1:2，1:3，2:1，3:1進行酶解，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度。

1.2.3 單因素試驗 研究不同酶解時間（1，1.5，2，2.5，3 h），復合酶加酶量（3000，4000，5000，6000，7000 U/g），溫度（30，35，40，45，50 ℃），pH（7，7.5，8，8.5，9）對北芪菇蛋白酶解的影響。固定研究因素底物濃度2 %，pH 7.5，加酶量5000 U/g，反應溫度40 ℃，酶解時間2 h，檢測DPPH·清除率及水解度[15]。

1.2.4 響應面設計 自變量為酶解時間、加酶量、酶解溫度、pH值，響應值為DPPH·清除率，設計4因素3水平的響應面分析[10,14]，具體設定見表2。結果采用Design-Expert.8.0.6.1軟件進行分析。

表2 響應面試驗因素及水平

1.2.5 DPPH·清除率的測定 按表3加樣，震蕩，混勻后避光保存30 min，于517 nm處每3 min測一次吸光度（A），直至A值保持穩(wěn)定。每一A值需進行3次重復試驗以減小誤差。計算公式[16]見式1。

表3 DPPH·清除率試驗加樣表

1.2.6 水解度測定 選用pH-stat滴定法[17]，計算公式見式2。

式中，V（ml）=消耗堿的體積；C（mol/L）=消耗堿的濃度；m（g）=蛋白質總量；h=每克蛋白中肽鍵數(shù)（7.52 mmol/g）[18]；α是α-氨基酸的平均解離度，α=10pH-pKa/(1+10pH-pKa)，pH是反應初始的pH值，pKa=7.8+2400×(298-T)/298T，T=273.15+t，t為反應環(huán)境的溫度。

1.2.7 抗氧化試驗 ABTS·+清除率試驗 采用ABTS法[19]測定北芪菇蛋白水解液的抗氧化性，以抗壞血酸作標準對照品進行比較。

用磷酸鹽緩沖溶液制得7 mmol/LABTS溶液40 ml，加入2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液40 ml混勻，再用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至734 nm處A為0.70±0.02，制成ABTS·+溶液。按表4加樣，于734 nm處測定A值。計算公式見式3。

表4 ABTS加樣表

1.2.8 抗氧化試驗 總還原力試驗 對北芪菇蛋白水解液進行總還原力的測定[20]，以抗壞血酸作為標準對照品進行測定。

取2 ml待測液加2.5 ml pH為6.6的PBS緩沖液和2.5 ml 1%鐵氰化鉀溶液，混合后50 ℃水浴20 min，冷卻后加入1 ml 10%的三氯乙酸溶液，5000 r/min離心10 min，取2.5 ml上清，加入2.5 ml蒸餾水和0.5 ml 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，放置10 min后在700 nm波長處測定A。以80 %的乙醇溶液作為空白組對照。

2 結果與分析

2.1 復合蛋白酶的選擇

2.1.1 蛋白酶的篩選 由圖1可見，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對北芪菇蛋白的DPPH·清除率和水解能力均高于其他兩種酶，所以選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶復合進行后續(xù)試驗。

圖1 酶的種類對DPPH·清除率和水解度的影響

2.1.2 加酶方式的選擇 由圖2可見，在DPPH·清除率指標中，中性加堿性酶比堿性加中性酶要高，但是在水解度指標中，堿性加中性酶比中性加堿性酶高。綜合考慮，選擇復合酶在中性蛋白酶最適合的溫度40 ℃和pH值7.5條件下水解。

圖2 加酶方式對DPPH·清除率和水解度的影響

2.1.3 加酶比例的選擇 由圖3可見，加酶比例為1:1時DPPH·清除率比2:1略高，明顯高于其他組，且水解度最高。因此，確定最適的加酶比例為中性蛋白酶:堿性蛋白酶=1:1。

圖3 加酶比例對DPPH·清除率和水解度的影響

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解時間對DPPH·清除率和水解度的影響 由圖4可見，隨反應時間的延長，DPPH·清除率先上升后緩慢下降，在反應1.5 h處達到最大值，1.5 h以后DPPH·清除率逐漸降低可能是抗氧化性多肽又進一步被分解為氨基酸或者小分子多肽[21]。水解度先增加后保持不變，在反應2 h處達到峰值并穩(wěn)定，可能是因為底物與蛋白酶充分反應。因此，選擇1.5 h為合適的酶解時間。

圖4 時間對DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.2 加酶量對DPPH·清除率和水解度的影響 由圖5可見，DPPH·清除率先上升后下降，在加酶量5000 U/g處達到峰值，可能是北芪菇蛋白在酶量剛開始增加時先被水解成具有抗氧化性的多肽[22]，隨著酶量的逐漸增加，抗氧化性的多肽又進一步被水解為氨基酸和小分子肽。隨著酶用量的增加，水解度先增大后基本保持穩(wěn)定，添加量在4000 U/g時達到最大值，可能是因為底物與蛋白酶已經充分反應。綜合考慮，選擇5000 U/g為合適的加酶量。

圖5 加酶量對DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.3 溫度對DPPH·清除率和水解度的影響 由圖6可見，隨著溫度的升高，DPPH·清除率和水解度先增大后減小，在溫度達到40 ℃時，DPPH·清除率和水解度均達到峰值。原因可能是溫度過低時酶活性較低，隨著溫度的升高，酶促反應加快，水解度增大，得到更多的抗氧化性多肽，超過最適溫度后，酶活性會降低，甚至會失活，導致水解度減小，抗氧化性多肽數(shù)量減少[23]。綜合考慮，選擇40 ℃為合適的酶解溫度。

圖6 溫度對DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.4 pH對DPPH·清除率和水解度的影響 由圖7可見，隨pH值的增大，DPPH·清除率和水解度先增大后降低。pH為7.5時，DPPH·清除率達到最大值，pH值為8時，水解度達到最大值。原因可能是蛋白酶有最適pH值，遠離最適pH值會降低水解能力，水解蛋白的數(shù)量減少，得到的抗氧化性多肽數(shù)量也會減少，因而導致DPPH·清除率降低[24]。綜合考慮，選擇7.5為最適pH。

圖7 pH對DPPH·清除率和水解度的影響

2.3 響應面結果分析

2.3.1 響應面試驗結果與方差分析 根據(jù)單因素試驗結果，以酶解時間、加酶量、酶解溫度、pH值為自變量，DPPH·清除率為響應值進行響應面分析，結果見表5。

表5 響應面分析實驗結果

采用Design-Expert.8.0.6.1軟件對表4數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得回歸方程：DPPH·清除率（%）Y=57.20-2.49A+1.88B-4.49C-0.83D-3.38AB+5.25AC+0.35AD+1.22BC-1.55BD+1.80CD-8.06A2-13.85B2-17.69C2-13.40D2。

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表6。一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2、D2和交互項AB、AC對DPPH·清除率具有極顯著影響。此回歸模型P＜0.0001，失擬項P＞0.05，表明該模型可靠。R2=0.9944，表明擬合值與試驗數(shù)據(jù)具有高度擬合性。R2Adj=0.9887，表明該模型能解釋98.87%的響應值變化。因此，用此模型優(yōu)化酶解北芪菇蛋白制備抗氧化肽的工藝是可行的。

表6 回歸模型方差分析結果

2.3.2 響應曲面圖結果 各因素之間的交互作用對響應值的影響見圖8。AC的響應面曲線較陡，且等高線圖更偏橢圓形，因此AC的交互作用對DPPH·清除率的影響最為顯著。其中，溫度對DPPH·清除率的影響大，表現(xiàn)為響應曲面的梯度較陡峭，等高線較密度較大；時間對DPPH·清除率的影響較小，表現(xiàn)為響應曲面的梯度較平，等高線密度較小[25]。交互作用對DPPH·清除率的影響大小順序為：AC＞AB＞CD＞BD＞BC＞AD。

圖8 各因素對DPPH·清除率影響的響應面圖和等高線圖

2.3.3 驗證試驗 運用Design-Expert.8.0.6.1軟件分析由模型預測可見，在時間1.39 h，加酶量5091 U/g，溫度39.2 ℃，pH 7.47的條件下酶解，DPPH·清除率可達57.95 %。考慮到試驗條件和現(xiàn)實情況，確定最優(yōu)實驗條件為時間1.5 h，5100 U/g，溫度40 ℃，pH 7.5。進行3次平行試驗，DPPH·清除率為58.20 %±0.23 %，與預測值相差較小，結果可靠。

2.4 抗氧化試驗結果

抗氧化試驗結果見表7，表明北芪菇蛋白水解液所得的多肽具有抗氧化性。

表7 抗氧化指標

3 結論

本文采用復合酶解的方式，研究制備北芪菇蛋白抗氧化性多肽的最佳工藝條件，并驗證所得多肽抗氧化活性。確定制備北芪菇蛋白抗氧化肽的最佳工藝參數(shù)為：酶解時間1.5 h，復合酶添加量5100 U/g，酶解溫度40 ℃，pH 7.5。在此條件下，得到的抗氧化性多肽的DPPH·清除率為58.20 % ±0.23 %，ABTS·+清除率為81.13 %±1.09 %，總還原力為0.3393±0.0023，可以說明北芪菇蛋白水解液所得的多肽具有抗氧化性。

本研究為酶法制備北芪菇蛋白抗氧化肽提供最佳工藝條件，為進一步研究其抗氧化性提供理論基礎。之后可以就北芪菇抗氧化肽在體內抗氧化作用及作用機制進行深入研究，為北芪菇的深加工以及抗氧化肽的發(fā)展提供技術和理論支持。