陳學(xué)蓮，藏 偉，劉 宇，姜站站，彭 帥，王 婧

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

近年來，葡萄種植模式對釀酒微生物及葡萄酒品質(zhì)的影響逐漸成為葡萄酒領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。目前，常見的葡萄種植模式分為常規(guī)（conventional，CV）種植、有機(jī)種植及生物動力（biodynamic，BD）種植。BD理念是由奧地利哲學(xué)家魯?shù)婪颉に固辜{于1924年提出，隨著人們對健康農(nóng)業(yè)的不斷追求，BD理念逐漸在葡萄種植、葡萄酒生產(chǎn)中流行起來[1]。CV種植允許使用化肥、農(nóng)藥、除草劑、殺菌劑等化學(xué)合成物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)的大量使用造成生態(tài)系統(tǒng)的破壞[2]，而BD種植禁止一切化學(xué)合成物質(zhì)的使用，可以施用特殊的配制劑（草本植物和礦物元素）以防治病蟲草害并使用堆肥、綠肥等有機(jī)肥料改良土壤，以此保護(hù)葡萄園的生態(tài)多樣性[3-4]。同時，BD葡萄酒的釀造采用自然發(fā)酵方式，以避免影響葡萄園微生物結(jié)構(gòu)，增加葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性[4]。

不同種植模式對葡萄園及葡萄漿果上附著的酵母菌群有一定影響[5]。據(jù)報道，BD種植增加了葡萄園微生物種群的豐富度和多樣性[6-7]。Bagheri等[8]采用可培養(yǎng)方法分析了南非某葡萄酒產(chǎn)區(qū)BD和CV種植模式下‘赤霞珠’葡萄自然發(fā)酵期間酵母菌群動態(tài)，發(fā)現(xiàn)BD種植的可培養(yǎng)酵母多樣性和物種豐富度均比較高。Perpetuini等[9]研究了不同種植模式對Montepulciano葡萄真菌多樣性和葡萄酒品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)BD種植的Montepulciano葡萄真菌多樣性更好，葡萄酒品質(zhì)更佳。與CV種植模式釀造的葡萄酒相比，BD種植模式釀造的葡萄酒口感更加醇厚，酒體協(xié)調(diào)，具有突出的花香、果香、植物性等復(fù)雜的氣味，且香氣更加濃郁[10]。Christopher等[11]也發(fā)現(xiàn)BD種植比CV種植模式下生產(chǎn)的葡萄酒有更好的香氣復(fù)雜性。然而，我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)關(guān)于不同葡萄種植模式對葡萄酒中酵母菌群以及葡萄酒香氣品質(zhì)的影響鮮見報道。

本研究采用酵母可培養(yǎng)方法和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析方法，針對賀蘭山東麓小產(chǎn)區(qū)博納佰馥酒莊采用BD和CV方法種植的‘赤霞珠’葡萄，分析‘赤霞珠’葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌群和香氣成分的動態(tài)變化，并對酵母菌群與香氣成分進(jìn)行了冗余分析（redundancy analysis，RDA），旨在明確不同種植模式對葡萄酒發(fā)酵過程中酵母菌群和香氣成分的影響，為酒莊在釀酒葡萄種植模式的選擇提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試釀酒葡萄原料‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon，Vitis viniferaL.）于2021年10月1日采自寧夏博納佰馥酒莊的葡萄園。寧夏博納佰馥酒莊位于賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)（寧夏，銀川），多年來分別采用BD和CV模式進(jìn)行葡萄種植。酒莊‘赤霞珠’葡萄為2011年定植的自根苗，獨(dú)龍干樹形，南北行向，其中BD種植葡萄園近5年來按照“BD認(rèn)證”要求進(jìn)行管理，如禁止使用農(nóng)藥、化肥等化學(xué)合成制劑，施用牛糞堆肥、綠肥，田間自然生草，使用BD配制劑以增強(qiáng)葡萄園抗病性等；CV種植葡萄園按照產(chǎn)區(qū)葡萄園管理規(guī)范進(jìn)行管理，如使用殺蟲劑、殺菌劑預(yù)防葡萄疾病，施用化肥，采用清耕法除草等。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：稱取酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加入1000 mL蒸餾水?dāng)嚢杌靹颍籛L（Wallerstein Laboratory）固體培養(yǎng)基：稱取80.25 g的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加入1000 mL蒸餾水，加熱煮沸混合均勻；賴氨酸培養(yǎng)基：稱取6.63 g商業(yè)賴氨酸培養(yǎng)基，加入100 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，加? mL的乳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH 4.8～5.2。所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

2-辛醇（色譜純）Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；微生物基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-150-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；WS-113手持糖度計 浙江托普儀器有限公司；TRACE1310-ISQ GC-MS儀 美國Thermo Scientific公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FOSS WineScan?葡萄酒分析儀丹麥福斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵和取樣

將從BD種植葡萄田和CV種植葡萄田采摘的‘赤霞珠’葡萄在田間混勻、除梗、破碎，轉(zhuǎn)入滅菌的5 L玻璃發(fā)酵罐，發(fā)酵罐低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自然發(fā)酵（25～27 ℃），樣品分別命名為BD樣品和CV樣品。每天早晚進(jìn)行一次壓帽處理，并測定糖度值。根據(jù)糖度值分別在發(fā)酵進(jìn)程的4 個時期[12]進(jìn)行采樣及指標(biāo)測定，即發(fā)酵前（糖度約23 °Bx，酒樣編號BDB、CVB），發(fā)酵中期（糖度值下降1/3時，約15～16 °Bx，酒樣為BDM、CVM）；發(fā)酵后期（糖度值下降2/3時，約8～9 °Bx，酒樣為BDL、CVL）；發(fā)酵末期（糖度值降至4 °Bx以下，酒樣為BDE、CVE）。發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行皮渣分離，靜置澄清。采用FOSS WineScan?葡萄酒分析儀分別測定未發(fā)酵葡萄醪（即BDB和CVB）和發(fā)酵末期樣品（即BDE和CVE）的基本理化指標(biāo)。

1.3.2 菌株的分離、純化、保藏

參考高娉娉等[13]的方法，利用WL鑒別培養(yǎng)基，進(jìn)行菌株的分離、純化，將純化后的菌株保存于40%滅菌甘油中，-80 ℃保藏。

1.3.3 菌株分子鑒定

1.3.31 酵母基因組DNA的提取

將保藏的酵母菌株從-80 ℃冰箱取出后放入4 ℃冰箱中解凍12 h，按照2%的接種量將酵母菌株加入YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再以2%的接種量轉(zhuǎn)接一次，使得菌株生物量達(dá)到（1～5）×107CFU/mL，取1.5 mL菌懸液于無菌離心管中，12000 r/min、4 ℃離心1 min。使用微生物基因組DNA提取試劑盒參照使用說明進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3.32 26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析

參照Wang Chunxiao等[14]的方法，使用N L 1（50-GCATCATCAATAGGGAGGAAAG-30）和NL4（50-GGTCCGGTTTCAAGAGCGG-30）引物擴(kuò)增分離菌株的26S rDNA D1/D2基因區(qū)域。利用1.5%瓊脂糖凝膠在90 V下電泳50 min，以檢查聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物的質(zhì)量。PCR產(chǎn)物被送至北京擎科生物公司進(jìn)行測序。使用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）將所獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫（美國國家生物技術(shù)信息中心）進(jìn)行比對，鑒定菌株。

1.3.4 香氣分析

利用HS-SPME-GC-MS進(jìn)行測定。對揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性定量分析，方法參照Gao Pingping等[15]并略作修改。

定性定量方法：香氣成分質(zhì)譜圖經(jīng)計算機(jī)在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫檢索比對，結(jié)合譜圖進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)物選用2-辛醇。

香氣活力值（odor activity value，OAV）是評價香氣物質(zhì)對葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)[16]，是由單一香氣物質(zhì)的濃度除以該物質(zhì)的閾值得到。香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度和OAV計算如式（1）、（2）所示：

式中：C為香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度/（μg/L）；S為香氣物質(zhì)的峰面積；C1為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度/（μg/L）；S1為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計，并通過IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）；通過SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA）；通過派森諾云平臺（https://www.genescloud.cn）進(jìn)行RDA；采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵曲線

兩種酒樣的自然發(fā)酵均能夠完成酒精發(fā)酵，從而得到干型葡萄酒，其酒精發(fā)酵進(jìn)程如圖1所示，在酒精發(fā)酵過程中，BD和CV樣品的糖度下降趨勢相似。第0～5天，BD和CV的發(fā)酵速率無明顯差異，糖度值降至約18 °Bx；在第6～9天CV的發(fā)酵速率比BD快，而在第9～10天BD的發(fā)酵速率比CV快，CV的糖度值降至8.5 °Bx左右，BD的糖度值降至10 °Bx左右；而在第11～14天BD和CV的發(fā)酵速率相似，并均在第14天完成酒精發(fā)酵（糖度＜4 °Bx）。

圖1 酒精發(fā)酵過程中糖含量變化Fig.1 Changes of sugar content during alcoholic fermentation

2.2 基本理化指標(biāo)

由表1可知，BDB和CVB總糖質(zhì)量濃度分別為235.67 g/L和230.13 g/L，BDB的總糖含量略高于CVB。而BDE和CVE總糖質(zhì)量濃度分別為0.60 g/L和0.77 g/L（＜4 g/L），表明BD和CV均已完成酒精發(fā)酵，此時BDE的乙醇體積分?jǐn)?shù)（13.95%）略高于CVE（13.5%），與糖含量的數(shù)據(jù)相對應(yīng)。BDB和CVB樣品中總酸質(zhì)量濃度分別為3.82 g/L和3.20 g/L，而發(fā)酵末期樣品BDE和CVE中總酸分別增加到7.41 g/L和5.60 g/L。pH值結(jié)果與總酸結(jié)果相對應(yīng)，發(fā)酵末期（BDE和CVE）的pH值低于發(fā)酵初期（BDB和CVB）。此外，由總酸和pH值數(shù)據(jù)可知，BD樣品酸度高于CV樣品。

表1 BD和CV葡萄醪和葡萄酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical indexes of grape must and wine from BD and CV

2.3 菌株分離、鑒定

通過對BD和CV自然發(fā)酵過程中分離的酵母菌株在WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的差異（圖2），結(jié)合26S rDNA D1/D2測序結(jié)果（表2），共分離到9 屬11 種酵母菌，分別為Saccharomyces cerevisiae、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora opuntiae、Starmerella bacillaris、Metschnikowia pulcherrima、Pichia kudriavzevii、Issatchenkia orientalis、Cryptococus flavescens、Kazachstania hellenica、Saccharomyces boulardii、Naganishia albida。

表2 酵母菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of yeast strains

2.4 酒精發(fā)酵過程中酵母菌群結(jié)構(gòu)演替及差異比較

酒精發(fā)酵不同階段分離的酵母菌群結(jié)構(gòu)變化如圖3所示。在所有樣品中共檢出11 種酵母菌。BDB樣品中有5 種酵母菌，其中H.uvarum占酵母總數(shù)的83.33%為優(yōu)勢酵母，S.bacillaris、P.kudriavzevii、I.orientalis、C.flavescens占比分別為3.57%、3.57%、5.96%和3.57%；而CVB樣品中有3 種酵母菌，其中H.uvarum為優(yōu)勢酵母，占酵母總數(shù)的75.34%，而M.pulcherrima和C.flavescens占比分別為23.28%和1.38%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在BDM樣品中酵母種類增多，衍生出4 種酵母菌，使BDM樣品由9 種酵母菌組成，分別為非釀酒酵母H.uvarum（38.18%）、S.bacillaris（9.0%）、P.kudriavzevii（7.27%）、I.orientalis（9.09%）、C.flavescens（5.45%）、H.opuntiae（7.27%）、N.albida（1.81%）和釀酒酵母屬的S.cerevisiae（18.3%）和S.boulardii（3.63%）；同時CVM樣品中也衍生出了4 種酵母菌，使CVM樣品由7 種酵母菌組成，即為H.uvarum、H.opuntiae、M.pulcherrima、S.bacillaris、K.hellenica、S.boulardii以及S.cerevisiae，占比分別為39.21%、9.8%、3.92%、11.67%、11.67%、3.92%和19.81%。在B D L 樣品中有7 種酵母菌，S.cerevisiae逐漸演替為優(yōu)勢酵母（57.14%），S.boulardii占比升高為5.35%，而非釀酒酵母比例降為37.51%，其中H.uvarum的比例為21.34%；CVL中S.cerevisiae成為了優(yōu)勢酵母（61.40%），而非釀酒酵母種類減少，此時H.uvarum、H.opuntiae、S.bacillaris和K.hellenica的比例分別為22.81%、5.26%、7.02%、3.51%。但是BDE樣品中只有2 種酵母，S.cerevisiae占比達(dá)到84.21%，非釀酒酵母只有H.uvarum（15.79%）；CVE樣品中有4 種酵母菌，S.cerevisiae占比增長到78.57%，非釀酒酵母有H.uvarum（10.71%）、H.opuntiae（7.14%）、S.bacillaris（3.58%）。

本研究中，隨著發(fā)酵進(jìn)行，非釀酒酵母種類呈現(xiàn)了先增加后減少趨勢，而S.cerevisiae占比逐漸增加，成為優(yōu)勢酵母，直到完成酒精發(fā)酵，這與葡萄酒自然發(fā)酵研究中酵母菌群變化規(guī)律一致[12,17-18]。BD與CV在發(fā)酵過程中酵母菌群結(jié)構(gòu)存在明顯區(qū)別，BD在發(fā)酵前期、中期和后期篩選出的酵母菌種類更多。Bagheri等[8]研究了不同種植模式對葡萄酒自然發(fā)酵過程中酵母種群動態(tài)變化，也發(fā)現(xiàn)BD的樣品中可培養(yǎng)酵母多樣性更高。但是發(fā)酵末期CV樣品中檢出的酵母種類比BD多，這可能是由于發(fā)酵末期BD樣品中pH值更低，對酵母菌的生長產(chǎn)生抑制作用[19]。

本研究篩選出了釀酒酵母屬的S.boulardii，其在葡萄酒微生物篩選中并不常見，通過基因分析可知，它與S.cereviseae親緣關(guān)系較近[20]。關(guān)于S.boulardii在葡萄酒發(fā)酵中的作用機(jī)制研究較少，但有研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的蔬菜汁中，S.boulardii可以增加酚類物質(zhì)含量，提高產(chǎn)品的抗氧化能力[21]。H.uvarum出現(xiàn)于BD和CV發(fā)酵的各個階段，說明其具有耐高糖、乙醇等脅迫因素的能力[22]。P.kudriavzevii和I.orientalis只存在于BD樣品中，其中P.kudriavzevii在葡萄酒發(fā)酵中可以產(chǎn)生酯類、醇類、甘油、乙酸等物質(zhì)，同時它還具有降酸的作用，能夠增加葡萄酒的風(fēng)味，改善葡萄酒整體的品質(zhì)[23-24]；而I.orientalis具有高產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯的能力并且具有耐乙醇、高溫等脅迫的能力[25]，在提高葡萄酒香氣方面具有很大的潛力。

2.5 香氣分析

葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分的種類、含量及其相互作用直接影響葡萄酒的品質(zhì)，決定葡萄酒的風(fēng)味和典型性[26]。在BD和CV發(fā)酵樣品中共檢測出67 種香氣物質(zhì)（表3），其中酯類和醇類物質(zhì)種類最多，含量最高。在BDB樣品中共檢出31 種物質(zhì)，BDM和BDL樣品中均檢出56 種物質(zhì)，BDE樣品中共檢出47 種物質(zhì)。在CVB樣品中共檢出34 種物質(zhì)，CVM樣品中共檢出51 種物質(zhì)，CVL和CVE樣品中均檢出47 種物質(zhì)。而BD樣品中香氣化合物總質(zhì)量濃度（75476.28 μg/L）顯著高于CV（52182.32 μg/L）。為了準(zhǔn)確分析香氣物質(zhì)對葡萄酒的貢獻(xiàn)，采用OAV確定重要香氣物質(zhì)，以發(fā)酵末期（BDE和CVE）樣品中的香氣物質(zhì)濃度除以該物質(zhì)的閾值，得到該物質(zhì)的OAV，并選用OAV＞0.1的23 種物質(zhì)進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分的分析與討論[16]。

表3 BD和CV酒精發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣物質(zhì)及含量Table 3 Volatile aroma components and their contents in BD and CV during alcoholic fermentation

酯類是葡萄酒重要的香氣成分，主要在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中產(chǎn)生，可以賦予葡萄酒愉悅的果香和花香，對葡萄酒香氣的形成起著至關(guān)重要的作用[27-28]。在BD和CV不同發(fā)酵階段的樣品中共檢出21 種酯類物質(zhì)（表3），而如圖4A所示，CVE樣品中酯類物質(zhì)含量顯著高于BDE。本研究共篩選出OAV＞0.1的酯類物質(zhì)有10 種，其中丁酸乙酯、庚酸乙酯、反-2-己烯酸乙酯、辛酸甲酯及3-甲基丁酸乙酯質(zhì)量濃度在釀造過程中呈上升趨勢，而3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯及苯乙酸乙酯在BDE中含量顯著高于CVE，這些物質(zhì)可為葡萄酒帶來花香、玫瑰等香氣。相比于BDE，CVE樣品中出現(xiàn)了非釀酒酵母H.opuntiae與S.bacillaris（圖3），而它們在發(fā)酵過程中可以代謝產(chǎn)生酯類物質(zhì)，如乙酸乙酯、乙酸異戊酯等[29-30]，這可能導(dǎo)致了CVE酯類含量高于BDE。

圖4 BD和CV酒精發(fā)酵不同階段揮發(fā)性香氣物質(zhì)及含量Fig.4 Volatile aroma components and their contents in BD and CV during alcoholic fermentation

醇類物質(zhì)是酵母菌氨基酸代謝的副產(chǎn)物，對葡萄酒香氣品質(zhì)的影響較大[23]。在BD和CV不同發(fā)酵階段的樣品中共檢出22 種醇類物質(zhì)，且在發(fā)酵過程中含量呈上升趨勢。如表3所示，OAV＞0.1的醇類物質(zhì)有5 種，其中異戊醇和2-苯乙醇在BDE樣品中的質(zhì)量濃度顯著高于CVE。而有國外研究也發(fā)現(xiàn)BD葡萄酒中異戊醇含量更高[31]。除S.cerevisiae外，非釀酒酵母P.kudriavzevii、S.bacillaris、H.uvarum是葡萄酒發(fā)酵過程中異戊醇和2-苯乙醇合成的主要貢獻(xiàn)菌[23-24,32]，本研究發(fā)現(xiàn)P.kudriavzevii、S.bacillaris主要出現(xiàn)在BD發(fā)酵過程中，這可能導(dǎo)致異戊醇和2-苯乙醇含量的升高。

醛、酮類物質(zhì)主要由酵母菌發(fā)酵引起的脂肪酸氧化和氨基酸降解產(chǎn)生，葡萄酒中醛酮類物質(zhì)對葡萄酒香氣的復(fù)雜性有積極影響[33]。在不同發(fā)酵階段的樣品中共檢測出5 種醛類物質(zhì)和8 種酮類物質(zhì)，但在BDE和CVE樣品中未檢測出酮類物質(zhì)（表3）。在發(fā)酵末期（BDE和CVE）樣品中，OAV＞0.1的醛類物質(zhì)有乙縮醛、癸醛、正壬醛。乙縮醛在BDE樣品中的含量顯著高于CVE，其具有堅果、泥土等氣味。正壬醛表現(xiàn)出生青、辛辣等香氣特征，僅在CVE樣品中被檢出，而在BDE和CVE樣品中癸醛含量則無明顯差異（表3）。S.cerevisiae在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生少量醛、酮類物質(zhì)[18]，但是關(guān)于非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵中產(chǎn)生醛、酮類物質(zhì)的報道并不多，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

萜烯類物質(zhì)可以增加葡萄酒的花香、果香等香氣特征[15]。在BD和CV不同發(fā)酵階段的樣品中共檢測出5 種萜烯類物質(zhì)（表3）。如圖4E所示，在BD和CV酒精發(fā)酵不同階段，萜烯類物質(zhì)含量呈上升趨勢，且BD樣品各階段的含量均高于CV。OAV＞0.1的萜烯類物質(zhì)有3 種，其中芳樟醇只出現(xiàn)在BD樣品中，其散發(fā)出玫瑰、水果氣味。葡萄酒中的萜烯類物質(zhì)的產(chǎn)生主要依賴于一些非釀酒酵母[13]，它們能夠代謝出高酶活的β-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵產(chǎn)生萜烯類物質(zhì)，如芳樟醇、香葉醇等[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前、中、后期中，BD樣品中發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母種類均高于CV樣品，而在發(fā)酵過程中更多的非釀酒酵母參與可能在葡萄酒產(chǎn)生大量的萜烯類物質(zhì)。

脂肪酸可以賦予葡萄酒更多的脂肪、水果或干酪等氣味，對葡萄酒香氣的復(fù)雜性起著重要作用[12,36]。在BD和CV不同發(fā)酵階段的樣品中檢測到2 種脂肪酸類物質(zhì)（表3），即辛酸和2-甲基己酸。辛酸含量在發(fā)酵過程中逐漸增加，但在BDE中其含量略低CVE。2-甲基己酸只在BD樣品中被檢出，它在葡萄酒中表現(xiàn)出脂肪、奶油等香氣。酵母菌可以在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生少量脂肪酸類物質(zhì)[23,37]，但具體的代謝途徑還不清晰，值得進(jìn)一步關(guān)注。

由上述香氣物質(zhì)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BDB和CVB樣品中各類香氣物質(zhì)含量沒有顯著差異，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，香氣物質(zhì)含量發(fā)生了明顯變化。葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群落的演替和代謝過程能夠影響葡萄酒香氣成分的含量[12,36]。為了進(jìn)一步研究酵母菌群與香氣成分之間的相關(guān)性，采用OPLS-DA分析BD和CV不同發(fā)酵階段樣品的全部香氣成分，并篩選出兩組樣品中的特征香氣物質(zhì)，并且利用RDA研究發(fā)酵過程中酵母菌群與特征香氣物質(zhì)之間的潛在相關(guān)性。

2.6 OPLS-DA

OPLS-DA是基于偏最小二乘法的一種回歸分析，對香氣物質(zhì)進(jìn)行可視化趨勢分析[38]，本研究選用表3中BD和CV酒精發(fā)酵不同階段的香氣物質(zhì)和含量進(jìn)行了OPLSDA。如圖5A所示，BD和CV不同發(fā)酵階段的樣品被明顯區(qū)分為3 類，2 個主成分可以反映總體94.42%的原始變量信息，其中和Q2分別為 0.999、0.812和0.848，說明模型可以反映樣品間香氣成分的總體情況，且模型穩(wěn)定。BDB、CVB、BDM、CVM均分布于第1象限，BDL、BDE均分布于第2象限，CVL、CVE均分布于第3象限，說明BD和CV發(fā)酵階段的樣品之間存在差異，其中BD和CV發(fā)酵前期（BDB和CVB）與發(fā)酵中期（BDM和CVM）樣品間差異較小，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵后期及末期BD與CV樣品的差異明顯，但同一處理條件下，樣品間并沒有明顯區(qū)別。

圖5 酒精發(fā)酵階段葡萄酒香氣物質(zhì)OPLS-DAFig.5 OPLS-DA analysis of wine aroma components during alcoholic fermentation

VIP可以用于篩選特征香氣物質(zhì)[39]，圖5B為不同香氣物質(zhì)（X）與不同發(fā)酵階段（Y）OPLS-DA主成分載荷圖，代表了該主成分對該類香氣物質(zhì)貢獻(xiàn)程度的大小。物質(zhì)與中心點(diǎn)越遠(yuǎn)，該物質(zhì)的載荷值越大，則該物質(zhì)的VIP值越大。本研究以VIP＞1為指標(biāo)，共篩選出11 種特征香氣物質(zhì)（表3）用于后續(xù)RDA。

2.7 RDA

由圖6所示，S.cerevisiae與異戊醇、2-苯乙醇、辛酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、正己醇、乙縮醛呈正相關(guān)，S.boulardii與苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯呈正相關(guān)。研究表明S.cerevisiae在酒精發(fā)酵期間可以產(chǎn)生酯類和醇類、醛類等次級代謝物質(zhì)，同時可以分泌果膠酶和纖維素酶并且釋放葡萄表皮的色素和風(fēng)味物質(zhì)，對葡萄酒的感官特性產(chǎn)生積極影響[18,39]。然而，關(guān)于S.boulardii的研究主要集中在其益生菌特性上，該菌種對葡萄酒香氣品質(zhì)的影響還有待研究。H.uvarum和M.pulcherrima與正己醇呈正相關(guān)，H.opuntiae、S.bacillaris、K.hellenica、P.kudriavzevii、N.albida與苯甲醛、乙酸乙酯呈正相關(guān)，而C.flavescens與苯甲醛呈正相關(guān)。非釀酒酵母能分泌酯酶、糖苷酶等一些胞外酶，這些酶可以利用葡萄原料中的香氣前體物質(zhì)，形成酯類、醇類、醛類等香氣物質(zhì)[29]。特別是H.opuntiae和S.bacillaris在發(fā)酵過程中能夠生成乙酸乙酯、苯甲醛等香氣物質(zhì)，提升了葡萄酒香氣的復(fù)雜性[22,30]，也有研究表明P.kudriavzevii在葡萄酒中能夠產(chǎn)生乙酸乙酯，從而提高葡萄酒品質(zhì)[24]。

圖6 酵母菌群和香氣物質(zhì)的RDAFig.6 RDA plot showing the correlation between yeast community and aroma components

3 結(jié)論

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)博納佰馥酒莊通過CV和BD種植管理的‘赤霞珠’葡萄，在自然發(fā)酵過程中酵母群落結(jié)構(gòu)差異顯著，其中BD種植模式下的葡萄酒酒精發(fā)酵過程中出現(xiàn)了7 屬9 種酵母菌，即H.uvarum、S.bacillaris、P.kudriavzevii、I.orientalis、C.flavescens、H.opuntiae、N.albida、S.cerevisiae和S.boulardii，其中H.uvarum為發(fā)酵前期優(yōu)勢酵母，S.cerevisiae為發(fā)酵后期和末期的優(yōu)勢酵母。而CV種植模式下的發(fā)酵過程中出現(xiàn)了6 屬8 種酵母菌，分別為H.uvarum、C.flavescens、H.opuntiae、M.pulcherrima、S.bacillaris、K.hellenica、S.boulardii以及S.cerevisiae，H.uvarum也為發(fā)酵前期的優(yōu)勢酵母，S.cerevisiae為發(fā)酵后期和末期的優(yōu)勢酵母。在葡萄酒香氣物質(zhì)的表現(xiàn)上，BD種植模式下的葡萄酒酒精發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)總含量高于CV種植模式。通過RDA，S.cerevisiae與除苯甲醛外的特征香氣物質(zhì)呈正相關(guān)，而S.boulardii與苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯呈正相關(guān)；非釀酒酵母主要影響醇類、醛類和酯類香氣物質(zhì)，其中H.uvarum和M.pulcherrima與正己醇呈正相關(guān)，C.flavescens與苯甲醛呈正相關(guān)，H.opuntiae、S.bacillaris、K.hellenica、P.kudriavzevii、N.albida與苯甲醛、乙酸乙酯呈正相關(guān)。結(jié)果表明BD種植模式能夠豐富酵母菌群多樣性，進(jìn)而影響葡萄酒香氣的復(fù)雜性。