◎ 劉 騫，沈 菁，劉 軍，陳 鑫，程運(yùn)斌

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064）

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的酒精度不低于7.0%vol的發(fā)酵酒。葡萄酒中含有多種氨基酸、水溶性維生素以及多種抗氧化物質(zhì)，有助于人們抵御心血管疾病，預(yù)防在血管中形成血栓，促進(jìn)血液循環(huán)等功效[1]。為了去除葡萄酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的苦味并增加回甜的口感，會向葡萄酒中加入一定量的甜蜜素，但是甜蜜素過量添加會導(dǎo)致果味葡萄酒存在一定的飲用安全風(fēng)險[2]。

甜蜜素是一種通過人工化學(xué)合成的甜味劑，其化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，其甜度為蔗糖的30～40 倍，被廣泛應(yīng)用于食品加工中?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760ü 2014）中明確規(guī)定，在蒸餾酒和發(fā)酵酒中均不得添加甜蜜素，而在配制酒中可以適量添加甜蜜素，但最大使用量不超過0.65 g·kg-1[3]。近年來，甜蜜素濫用的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生[4]，如果長期食用甜蜜素含量超標(biāo)的食品，會對人體的健康造成危害。馬麟莉等[5]研究表明過量的甜蜜素會對人體的肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)造成不良影響，因此建立一種簡便快捷檢測甜蜜素含量的方法是保障食品安全的有效途徑之一。目前，檢測甜蜜素的常用方法有氣相色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-11]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因?yàn)橘|(zhì)譜儀本身價格昂貴，還易受樣品基質(zhì)的干擾，適用范圍窄；氣相色譜法需要先對甜蜜素進(jìn)行衍生反應(yīng)，該反應(yīng)是一個低溫反應(yīng)，不易把控甜蜜素的衍生化率，導(dǎo)致檢測結(jié)果的穩(wěn)定性不好；液相色譜法雖然也需先對甜蜜素進(jìn)行衍生反應(yīng)，但是該反應(yīng)是一個簡單的常溫反應(yīng)，容易控制甜蜜素的衍生化率，從而獲得穩(wěn)定的檢測結(jié)果。因此本試驗(yàn)通過優(yōu)化高效液相色譜法，建立了一種簡便、快速有效檢測果味葡萄酒中甜蜜素含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

日式果味葡萄酒，超市購買；乙腈和正庚烷為色譜純；硫酸、次氯酸鈉、氫氧化鈉和碳酸氫鈉，均為分析純試劑，其中次氯酸鈉溶液需要保持有效氯含量在50 g·L-1以上；甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品（10 mg·mL-1，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；實(shí)驗(yàn)用水為新制備的超純水。

1.1.2 儀器

SHIMADZU LC-10AD 高效液相色譜儀；Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Milli-Q超純水儀器；電子天平；恒溫水浴鍋；旋渦混合器，IKA；精密移液槍，Transferpette；過濾頭（濾膜孔徑約為0.22 μm）。

1.2 液相色譜條件

流動相為乙腈-水體系（70 ∶30，V∶V），流速為1.0 mL·min-1；柱溫為40 ℃；檢測波長為314 nm；進(jìn)樣體積為10 μL，由甜蜜素轉(zhuǎn)化的N,N-二氯環(huán)己胺的保留時間為15 min。

1.3 樣品前處理及衍生方法

稱取5.0 g 果味葡萄酒樣品于小燒杯中，用氫氧化鈉溶液調(diào)至弱堿性（pH 為7～8）再放入恒溫水浴鍋中以60 ℃加熱30 min 除去樣品中的酒精，放冷后用水定容至10.0 mL 備用。將上述樣品全都轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，先加入2.0 mL 硫酸溶液（硫酸與水的體積比為1 ∶1），再加入次氯酸鈉溶液（有效氯含量50 g·L-1以上）1.0 mL，振蕩搖勻1 min，靜置反應(yīng)10 min，然后加入正庚烷5.0 mL，劇烈振蕩1 min，靜置分層，除去水層后在正庚烷層加入25.0 mL 碳酸氫鈉溶液（50.0 g·L-1），振蕩1 min，靜置取上層有機(jī)相經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，濾液上機(jī)備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

準(zhǔn)確移取濃度為10 000.0 mg·L-1的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用水定容至10.0 mL 配制成甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 000.0 mg·L-1。準(zhǔn)確移取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL 和2.0 mL 于10.0 mL容量瓶中定容配制成濃度為10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述配制的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.4 中的處理方法進(jìn)行衍生化（標(biāo)準(zhǔn)溶液不需要進(jìn)行去除酒精步驟）得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5 計算方法

樣品中甜蜜素含量的計算公式為

式中：X為樣品中甜蜜素的含量，g·kg-1；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品定容溶液中甜蜜素的濃度，mg·L-1；V為樣品溶液最后定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。計算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化試劑的加入順序

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97ü 2016）中衍生化試劑的加入順序?yàn)榱蛩?、正庚烷和次氯酸溶液，劇烈振? min 后靜置分層。檢測環(huán)己基氨基磺酸鈉的原理是將食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉用水提取后，在強(qiáng)酸性溶液中與次氯酸鈉反應(yīng)，生成N,N-二氯環(huán)己胺，再用正庚烷萃取后，可用高效液相色譜儀檢測，環(huán)己基氨基磺酸鈉的衍生化反應(yīng)是一個在水相中的反應(yīng)，如果在加入次氯酸鈉之前就加入正庚烷會不利于環(huán)己基氨基磺酸鈉與次氯酸鈉的反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)轉(zhuǎn)化率降低，上樣后儀器響應(yīng)值低，降低檢測靈敏度。因此，在本次試驗(yàn)中衍生化試劑的加入順序改為先加入硫酸溶液酸化提取體系，再加入次氯酸鈉充分反應(yīng)，最后再加入正庚烷萃取環(huán)己基氨基磺酸鈉的衍生產(chǎn)物。不同的衍生化試劑加入順序的色譜圖見圖1、圖2。

圖1 50 mg·L-1 甜蜜素標(biāo)樣色譜圖（衍生化試劑加入順序依次為硫酸、正庚烷和次氯酸鈉）

圖2 50 mg·L-1 甜蜜素標(biāo)樣色譜圖（衍生化試劑加入順序依次為硫酸、次氯酸鈉和正庚烷）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍

分別對甜蜜素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg·L-1、20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1）進(jìn)行上機(jī)測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，甜蜜素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出衍生后的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與濃度在10～200 mg·L-1呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=175 709x-11 744.7，相關(guān)系數(shù)為0.998 0，檢出限為0.003 g·kg-1，定量限為0.01 g·kg-1（10 倍信噪比），該方法可用于外標(biāo)法定量甜蜜素的含量。

圖3 甜蜜素衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 果味葡萄酒樣品的測定

在1.3 的色譜條件下上機(jī)測定果味葡萄酒樣品中甜蜜素的含量，見圖4、圖5。果味葡萄酒樣品中不含有甜蜜素衍生物，因此果味葡萄酒樣品中未檢出甜蜜素，基線比較平穩(wěn)，沒有其他雜峰干擾。

圖4 添加了甜蜜素的果味葡萄酒樣品色譜圖（添加水平為0.2 g·kg-1）

圖5 果味葡萄酒樣品色譜圖

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

稱取果味葡萄酒樣品5.00 g，向樣品中加入一定量的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中甜蜜素的含量分別為0.03 mg·g-1、0.06 mg·g-1、0.20 mg·g-1。分別平行測定5 次，測定數(shù)據(jù)見表1，結(jié)果表明該果味葡萄酒樣品的加標(biāo)回收率為88.9%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%～6.23%。

表1 甜蜜素在果味葡萄酒中的添加回收率結(jié)果表

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立并優(yōu)化了檢測果味葡萄酒中甜蜜素的方法，相關(guān)系數(shù)為0.998 0，檢出限為0.003 g·kg-1，定量限為0.01 g·kg-1，樣品加標(biāo)回收率為88.9%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.15%～6.23%。該方法準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到國標(biāo)中檢測分析要求。此方法前處理操作簡單，衍生化反應(yīng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，適用于檢測果味葡萄酒或者類似酒類樣品中甜蜜素的含量。