◎ 林 濤，田 恒，唐艷梅，何紹鴻，陳興連，張 嬌，杜麗娟，劉宏程

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2.西南林業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224；3.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650106；4.云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650504）

石斛是國家衛(wèi)健委公布的可用于保健食品的中草藥，具有良好的生物保健功效[1-2]，在云南省有大量種植，其中龍陵產(chǎn)的紫皮石斛和廣南的鐵皮石斛因其獨(dú)特的生長環(huán)境而形成特有的生物保健功能，已經(jīng)成為我國的國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[3-5]。紫皮石斛和鐵皮石斛在云南省的大部分地區(qū)都有種植，特別是在龍陵地區(qū)，大量種植紫皮石斛和鐵皮石斛，但該地區(qū)產(chǎn)的鐵皮石斛因其不屬于原生態(tài)產(chǎn)地而在品質(zhì)上難以超越紫皮石斛[6-7]。因此，如何采用快速簡便的方式鑒別龍陵地區(qū)產(chǎn)的紫皮石斛和鐵皮石斛是目前的一個首要問題。

石斛品種的鑒別離不開其中活性成分的種類和含量變化，目前對于品種的鑒別常用的儀器是高分辨質(zhì)譜結(jié)合非靶向篩查技術(shù)[8-10]，前處理簡單但數(shù)據(jù)分析耗時費(fèi)力，且對于篩選出的特征化合物的結(jié)構(gòu)確證也較為困難。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報道，石斛中的活性成分主要包括酚類、黃酮、糖苷、苯丙醇苷等類型，不同的品種因其基因的表達(dá)量不同而使得活性成分的代謝累積量各不相同[4,11-13]。因此，本研究以常見的紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、異槲皮素、金絲桃苷糖苷、圣草酚、原兒茶酸和香草酸等酚類、黃酮、苷類物質(zhì)活性物質(zhì)為研究目標(biāo)，并對其在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量進(jìn)行測定，以期得到這9 種功能活性物質(zhì)在龍陵地區(qū)產(chǎn)的紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量分布，為兩種石斛的有效鑒別提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

26個石斛樣品，其中紫皮石斛和鐵皮石斛各13個，都采自云南省保山市龍陵地區(qū)。

AB Triple Quad 4500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，1 mm×50 mm，美 國Waters 公司）；Multi Reax 渦旋振蕩器[海道爾夫儀器設(shè)備（上海）有限公司]；KM-615C 超聲波提取儀（廣州科盟清潔技術(shù)有限公司）；ME204E 電子分析天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；純水儀（英國elga 公司）；TDL-5000bR 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

4 L 乙腈、4 L 甲醇（色譜純，德國merck 公司）；乙酸銨（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；甲酸（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；氨水（色譜純，美國Fisher 公司）；紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金絲桃苷、圣草酚、原兒茶酸（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；異槲皮素（純度≥99%，成都德思特生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別將紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金絲桃苷、圣草酚、原兒茶酸和異槲皮素利用甲醇溶解后稀釋為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種標(biāo)準(zhǔn)品再分別吸取1 mL 用甲醇定容到10 mL 得到100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，裝入棕色儲液瓶中于-4 ℃下保存。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g 石斛粉末于50 mL 離心管中，添加5.00 mL 的60%甲醇-水溶液，渦旋混勻后，冰浴下、80 Hz 超聲30 min，5 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，待檢測。

1.2.3 色譜條件

流動相A：甲醇；流動相B：0.1%氨水-水溶液；梯度洗脫條件：0～3 min，5%A →40%A，3～5 min，40%A →60%A，5～8 min，60%A →95%A，8～10 min，95%A；10.0 → 10.3 min，95%A →5%A；10.3～13.0 min，5%A；流速：200 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

采用ESI 離子源，正負(fù)離子同時掃描模式。氣簾氣流速：30 L·h-1；霧化氣流速：55 L·h-1；輔助氣流速：55 L·h-1；輔助加熱氣溫度：550 ℃；噴霧電壓：5 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。9 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 9 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)表

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用R 語言和Simca 軟件對26 個石斛樣品中的9 種活性成分進(jìn)行PCA 和VIP 的分析，篩選差異較大的活性成分，并進(jìn)行箱裝圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件的優(yōu)化

本研究中所測定的9 種活性化合物中只有紫丁香苷是采用正離子模式，其余8 種都是采用負(fù)離子模式。為了得到較優(yōu)的離子化效率，通常在負(fù)離子模式下，流動相中加入氨水以提高化合物的響應(yīng)值。因此，本研究比較了0.1%氨水和不加氨水對于化合物的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，氨水的加入能夠有效地提高8 種負(fù)離子模式化合物的響應(yīng)值，且對于正離子模式下紫丁香苷的電離沒有明顯的抑制作用。為保證大部分化合物的響應(yīng)情況，本研究選擇在流動相中加入0.1%氨水以提高負(fù)離子模式下化合物的響應(yīng)值。9種活性化合物的色譜圖如圖1所示。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

分別將9 種活性化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成不同梯度的溶液（表2），通過峰面積對標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行線性回歸分析；采用石斛基質(zhì)，添加9 種活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 倍信噪比確定方法的定量限。如表2 所示，9 種活性化合物在0.001～10.000 μg·mL-1濃度的線性相關(guān)系數(shù)較好（r2＞0.990 0），定量限為0.025～0.250 mg·kg-1，該方法的儀器檢測靈敏度較高。

表2 9 種活性化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限結(jié)果表

2.3 回收率和精密度

本試驗中以石斛作為試驗對象，分別以1 倍、5 倍和10 倍定量限作為添加濃度進(jìn)行回收率與精密度試驗。由表3 可知，9 種活性化合物的平均回收率為70.4%～79.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.27%～7.48%。

表3 9 種活性化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表

2.4 紫皮石斛和鐵皮石斛中9 種活性化合物含量

采用以上方法對26 個紫皮石斛和鐵皮石斛樣品進(jìn)行9 種活性化合物含量的測定，結(jié)果如表4 所示。

表4 9 種活性化合物在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量分布表 單位：mg·kg-1

2.5 紫皮石斛和鐵皮石斛功能活性物質(zhì)含量分析

試驗對9 種活性化合物的含量進(jìn)行PCA 分析。由圖2 可知，產(chǎn)自云南省龍陵地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛能夠被有效鑒別，說明采用特征活性成分結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法能夠?qū)ψ掀な丸F皮石斛進(jìn)行有效鑒別，即使是生長于相同的產(chǎn)地環(huán)境中，由于其中的特征活性成分存在較大的差異，也能夠明顯區(qū)別開。

圖2 紫皮石斛和鐵皮石斛的PCA 圖

圖3VIP 分析表明，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷活性化合物的VIP 值都＞1，表明其在紫皮石斛和鐵皮石斛的鑒別中起到了關(guān)鍵的作用，即為特征活性化合物。通過對該5 個特征活性化合物進(jìn)行小提琴圖分析（圖4）可知，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物在兩種石斛中的含量差異較大（P＜0.01），特別是柚皮苷在紫皮石斛中有檢出，但在鐵皮石斛中未檢出，可以作為鑒別紫皮石斛和鐵皮石斛的關(guān)鍵特征指標(biāo)。柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、改善糖和脂質(zhì)代謝等活性[19-21]。根據(jù)本試驗結(jié)果，鐵皮石斛中未檢測出柚皮苷含量，但在紫皮石斛中檢測出柚皮苷，這也是紫皮石斛保健功效和鐵皮石斛不同的原因，該研究結(jié)果可為紫皮石斛保健食品的開發(fā)提供新思路。

圖3 紫皮石斛和鐵皮石斛中特征活性化合物的VIP 圖

圖4 紫皮石斛和鐵皮石斛中特征活性化合物含量的小提琴圖

3 結(jié)論

本研究利用超聲冰浴輔助提取和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了紫皮石斛和鐵皮石斛中常見的9種活性化合物的測定方法。利用MRM 監(jiān)測正負(fù)離子同時掃描模式、外標(biāo)法定量，方法快速簡便且靈敏度高，適合石斛中9 種活性化合物的快速測定。對采自云南省龍陵地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛進(jìn)行9 種活性化合物的測定并進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果表明產(chǎn)自相同地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛能夠被有效鑒別，說明采用特征活性成分結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法能夠?qū)τ谧掀な丸F皮石斛進(jìn)行有效鑒別。柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物的VIP 值都＞1，其在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量差異較大（P＜0.01），特別是在紫皮石斛中檢出有柚皮苷，但在鐵皮石斛中未檢出該成分，可以作為鑒別紫皮石斛和鐵皮石斛的關(guān)鍵特征指標(biāo)。