◎ 林 濤，田 恒，唐艷梅，何紹鴻，陳興連，張 嬌，杜麗娟，劉宏程

（1.云南省農業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205；2.西南林業(yè)大學 材料與化學工程學院，云南 昆明 650224；3.云南經(jīng)濟管理學院 醫(yī)學院，云南 昆明 650106；4.云南民族大學 民族醫(yī)藥學院，云南 昆明 650504）

石斛是國家衛(wèi)健委公布的可用于保健食品的中草藥，具有良好的生物保健功效[1-2]，在云南省有大量種植，其中龍陵產(chǎn)的紫皮石斛和廣南的鐵皮石斛因其獨特的生長環(huán)境而形成特有的生物保健功能，已經(jīng)成為我國的國家地理標志產(chǎn)品[3-5]。紫皮石斛和鐵皮石斛在云南省的大部分地區(qū)都有種植，特別是在龍陵地區(qū)，大量種植紫皮石斛和鐵皮石斛，但該地區(qū)產(chǎn)的鐵皮石斛因其不屬于原生態(tài)產(chǎn)地而在品質上難以超越紫皮石斛[6-7]。因此，如何采用快速簡便的方式鑒別龍陵地區(qū)產(chǎn)的紫皮石斛和鐵皮石斛是目前的一個首要問題。

石斛品種的鑒別離不開其中活性成分的種類和含量變化，目前對于品種的鑒別常用的儀器是高分辨質譜結合非靶向篩查技術[8-10]，前處理簡單但數(shù)據(jù)分析耗時費力，且對于篩選出的特征化合物的結構確證也較為困難。根據(jù)相關文獻的報道，石斛中的活性成分主要包括酚類、黃酮、糖苷、苯丙醇苷等類型，不同的品種因其基因的表達量不同而使得活性成分的代謝累積量各不相同[4,11-13]。因此，本研究以常見的紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、異槲皮素、金絲桃苷糖苷、圣草酚、原兒茶酸和香草酸等酚類、黃酮、苷類物質活性物質為研究目標，并對其在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量進行測定，以期得到這9 種功能活性物質在龍陵地區(qū)產(chǎn)的紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量分布，為兩種石斛的有效鑒別提供一定的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

26個石斛樣品，其中紫皮石斛和鐵皮石斛各13個，都采自云南省保山市龍陵地區(qū)。

AB Triple Quad 4500 三重四極桿串聯(lián)質譜儀（美國AB Sciex 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，1 mm×50 mm，美 國Waters 公司）；Multi Reax 渦旋振蕩器[海道爾夫儀器設備（上海）有限公司]；KM-615C 超聲波提取儀（廣州科盟清潔技術有限公司）；ME204E 電子分析天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；純水儀（英國elga 公司）；TDL-5000bR 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

4 L 乙腈、4 L 甲醇（色譜純，德國merck 公司）；乙酸銨（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；甲酸（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；氨水（色譜純，美國Fisher 公司）；紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金絲桃苷、圣草酚、原兒茶酸（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；異槲皮素（純度≥99%，成都德思特生物技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別將紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金絲桃苷、圣草酚、原兒茶酸和異槲皮素利用甲醇溶解后稀釋為1 mg·mL-1的標準溶液，每種標準品再分別吸取1 mL 用甲醇定容到10 mL 得到100 μg·mL-1的混合標準溶液，裝入棕色儲液瓶中于-4 ℃下保存。

1.2.2 樣品前處理

準確稱量1.000 0 g 石斛粉末于50 mL 離心管中，添加5.00 mL 的60%甲醇-水溶液，渦旋混勻后，冰浴下、80 Hz 超聲30 min，5 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，待檢測。

1.2.3 色譜條件

流動相A：甲醇；流動相B：0.1%氨水-水溶液；梯度洗脫條件：0～3 min，5%A →40%A，3～5 min，40%A →60%A，5～8 min，60%A →95%A，8～10 min，95%A；10.0 → 10.3 min，95%A →5%A；10.3～13.0 min，5%A；流速：200 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

1.2.4 質譜條件

采用ESI 離子源，正負離子同時掃描模式。氣簾氣流速：30 L·h-1；霧化氣流速：55 L·h-1；輔助氣流速：55 L·h-1；輔助加熱氣溫度：550 ℃；噴霧電壓：5 500 V；采用多反應監(jiān)測模式（MRM）。9 種化合物的質譜參數(shù)見表1。

表1 9 種化合物的質譜參數(shù)表

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用R 語言和Simca 軟件對26 個石斛樣品中的9 種活性成分進行PCA 和VIP 的分析，篩選差異較大的活性成分，并進行箱裝圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 流動相條件的優(yōu)化

本研究中所測定的9 種活性化合物中只有紫丁香苷是采用正離子模式，其余8 種都是采用負離子模式。為了得到較優(yōu)的離子化效率，通常在負離子模式下，流動相中加入氨水以提高化合物的響應值。因此，本研究比較了0.1%氨水和不加氨水對于化合物的響應情況。結果表明，氨水的加入能夠有效地提高8 種負離子模式化合物的響應值，且對于正離子模式下紫丁香苷的電離沒有明顯的抑制作用。為保證大部分化合物的響應情況，本研究選擇在流動相中加入0.1%氨水以提高負離子模式下化合物的響應值。9種活性化合物的色譜圖如圖1所示。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

分別將9 種活性化合物標準溶液配制成不同梯度的溶液（表2），通過峰面積對標準濃度進行線性回歸分析；采用石斛基質，添加9 種活性化合物的標準溶液，以10 倍信噪比確定方法的定量限。如表2 所示，9 種活性化合物在0.001～10.000 μg·mL-1濃度的線性相關系數(shù)較好（r2＞0.990 0），定量限為0.025～0.250 mg·kg-1，該方法的儀器檢測靈敏度較高。

表2 9 種活性化合物的線性范圍、相關系數(shù)（r2）、檢出限和定量限結果表

2.3 回收率和精密度

本試驗中以石斛作為試驗對象，分別以1 倍、5 倍和10 倍定量限作為添加濃度進行回收率與精密度試驗。由表3 可知，9 種活性化合物的平均回收率為70.4%～79.2%，相對標準偏差為4.27%～7.48%。

表3 9 種活性化合物的回收率和相對標準偏差結果表

2.4 紫皮石斛和鐵皮石斛中9 種活性化合物含量

采用以上方法對26 個紫皮石斛和鐵皮石斛樣品進行9 種活性化合物含量的測定，結果如表4 所示。

表4 9 種活性化合物在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量分布表 單位：mg·kg-1

2.5 紫皮石斛和鐵皮石斛功能活性物質含量分析

試驗對9 種活性化合物的含量進行PCA 分析。由圖2 可知，產(chǎn)自云南省龍陵地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛能夠被有效鑒別，說明采用特征活性成分結合化學計量學的方法能夠對紫皮石斛和鐵皮石斛進行有效鑒別，即使是生長于相同的產(chǎn)地環(huán)境中，由于其中的特征活性成分存在較大的差異，也能夠明顯區(qū)別開。

圖2 紫皮石斛和鐵皮石斛的PCA 圖

圖3VIP 分析表明，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷活性化合物的VIP 值都＞1，表明其在紫皮石斛和鐵皮石斛的鑒別中起到了關鍵的作用，即為特征活性化合物。通過對該5 個特征活性化合物進行小提琴圖分析（圖4）可知，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物在兩種石斛中的含量差異較大（P＜0.01），特別是柚皮苷在紫皮石斛中有檢出，但在鐵皮石斛中未檢出，可以作為鑒別紫皮石斛和鐵皮石斛的關鍵特征指標。柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、改善糖和脂質代謝等活性[19-21]。根據(jù)本試驗結果，鐵皮石斛中未檢測出柚皮苷含量，但在紫皮石斛中檢測出柚皮苷，這也是紫皮石斛保健功效和鐵皮石斛不同的原因，該研究結果可為紫皮石斛保健食品的開發(fā)提供新思路。

圖3 紫皮石斛和鐵皮石斛中特征活性化合物的VIP 圖

圖4 紫皮石斛和鐵皮石斛中特征活性化合物含量的小提琴圖

3 結論

本研究利用超聲冰浴輔助提取和超高效液相色譜-串聯(lián)質譜建立了紫皮石斛和鐵皮石斛中常見的9種活性化合物的測定方法。利用MRM 監(jiān)測正負離子同時掃描模式、外標法定量，方法快速簡便且靈敏度高，適合石斛中9 種活性化合物的快速測定。對采自云南省龍陵地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛進行9 種活性化合物的測定并進行PCA 分析，結果表明產(chǎn)自相同地區(qū)的紫皮石斛和鐵皮石斛能夠被有效鑒別，說明采用特征活性成分結合化學計量學的方法能夠對于紫皮石斛和鐵皮石斛進行有效鑒別。柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物的VIP 值都＞1，其在紫皮石斛和鐵皮石斛中的含量差異較大（P＜0.01），特別是在紫皮石斛中檢出有柚皮苷，但在鐵皮石斛中未檢出該成分，可以作為鑒別紫皮石斛和鐵皮石斛的關鍵特征指標。