◎ 萬素琴，王多嬌，顏春榮，徐春祥，周 雪，張金秋

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210000）

丁香酚是一種常見的有機(jī)化合物，由于其自身具有一種濃郁的香味，常常被用作香料應(yīng)用于各種精油中，還可作為一種食用香料使用。丁香酚學(xué)名4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子式為C10H12O2，在常溫下主要呈現(xiàn)油狀液態(tài)，顏色為淡黃色和透明色，密度為1.06 g·cm-3，熔點(diǎn)為-10 ℃，沸點(diǎn)高達(dá)254 ℃，微溶于水且完全溶于部分有機(jī)溶劑。丁香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 丁香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

丁香酚價(jià)格低廉且具有良好的麻醉效果，常作為水產(chǎn)品的麻醉劑，并廣泛應(yīng)用于鮮活水產(chǎn)品的養(yǎng)殖、運(yùn)輸?shù)阮I(lǐng)域，其安全性及殘留控制等問題引發(fā)了諸多關(guān)注。當(dāng)前國際相關(guān)領(lǐng)域認(rèn)為將丁香酚用于水產(chǎn)品的麻醉具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，歐洲食品安全局認(rèn)為丁香酚達(dá)到一定含量會(huì)對生物的皮膚和視力產(chǎn)生影響；美國食品藥品管理局對于丁香酚的使用有非常嚴(yán)格的規(guī)定，明令禁止在水產(chǎn)品中出現(xiàn)丁香酚，被劃分為第3 類致癌物；部分東亞和大洋洲國家對于丁香酚的應(yīng)用很開放，日本規(guī)定丁香酚的最高殘留量（Maximum Residue Limit，MRL）設(shè)定為0.05 mg·kg-1，但規(guī)定了丁香酚的休藥期，甲殼類休藥期為10 d；新西蘭規(guī)定了丁香酚的最大殘留限量為0.1 mg·kg-1[1-3]。我國尚無明確的法規(guī)規(guī)定丁香酚類化合物可以作為水產(chǎn)麻醉劑使用，僅在GB 2760ü 2014 中規(guī)定丁香酚可作為食品級香料，但在水產(chǎn)品的使用卻沒有明確的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)對市售淡水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，通過科學(xué)、有效的監(jiān)測方式對淡水產(chǎn)品及暫養(yǎng)水中存在的丁香酚類化合物的種類、含量進(jìn)行分析。同時(shí)對丁香酚類化合物在水產(chǎn)品中的殘留量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測，使用魚用麻醉劑對鮮活鯽魚進(jìn)行麻醉給藥實(shí)驗(yàn)，觀察麻醉效果以及殘留量消除情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙?；惗∠惴樱―R.E）；淡水魚（農(nóng)貿(mào)市場）；乙腈、正己烷、二甲亞砜（色譜純，MERCK）。魚用麻醉劑（農(nóng)貿(mào)市場和網(wǎng)絡(luò)采樣）。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2020 島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊電離源）；7890B-7000D 安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子轟擊電離源）；XW-80A 旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司）；SL16R 高速離心機(jī)（美國賽默飛公司）；氮吹儀（tegent）；電子天平（METTLER）；增氧泵。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)態(tài)監(jiān)測麻醉給藥實(shí)驗(yàn)

市場自購鯽魚40 條，分成3 組，分別為空白對照組和2 個(gè)不同濃度丁香酚給藥組。低濃度長時(shí)間：丁香酚給藥濃度20 mg·L-1時(shí)，麻醉時(shí)長10 h；高濃度短時(shí)間：丁香酚給藥濃度100 mg·L-1，麻醉時(shí)長為5 min。用水沖洗后在放入復(fù)蘇空白池開始計(jì)時(shí)，在0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、12.0 h、24.0 h和48.0 h進(jìn)行取樣，觀察記錄鯽魚復(fù)蘇存活情況。觀察記錄魚體的外觀和臟器變化，同時(shí)按照實(shí)驗(yàn)樣品處理步驟對其體中丁香酚類的含量進(jìn)行測定，具體實(shí)驗(yàn)流程見圖2。

圖2 丁香酚麻醉實(shí)驗(yàn)流程圖

1.3.2 樣品前處理

稱取2.0 g 磨碎的魚腹部位魚肉樣品（去鱗、去頭、去內(nèi)臟）于50 mL 離心管中，加入一個(gè)陶瓷均質(zhì)子、5 g無水Na2SO4和10 mL 乙腈，超聲20 min，8 000 r·min-1離心3 min，收集上清液，以同樣的方法重復(fù)提取一次，合并上清液，加入5 mL 乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min，8 000 r·min-1離心8 min，棄去上清液，然后加入50 μL 二甲基亞砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，渦旋0.5 min，有機(jī)相濾膜過濾，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定6 種丁香酚類化合物的含量。

稱取5 g淡水產(chǎn)品的暫養(yǎng)水樣于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋5 min，加入5 g 無水MgSO4和一個(gè)陶瓷均質(zhì)子，繼續(xù)渦旋5 min，然后5 000 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確移取4 mL 上清液于50 mL 離心管中，加入50 μL 二甲基亞砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈，渦旋30 s，有機(jī)相濾膜過濾，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定6 種丁香酚類化合物的含量。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相色譜參數(shù)。色譜柱：VF-1701（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：柱溫初始為90 ℃，保持2 min，然后以5 ℃·min-1升至210 ℃，再以20 ℃·min-1升至250 ℃，保持1 min；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜參數(shù)。電離方式：電子轟擊電離源（EI）；EI 能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：6.00 min；采集方式：離子監(jiān)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售淡水魚及暫養(yǎng)水結(jié)果分析

通過對市售淡水魚進(jìn)行暫養(yǎng)并測定，檢出丁香酚，色譜圖見圖3。同時(shí)選取空白基質(zhì)樣品，在不同濃度的水中暫養(yǎng)并進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)水檢出濃度最高為24 mg·kg-1。檢出樣品中，草魚重量為1.98 kg，檢出丁香酚為8.3 mg·kg-1；鯽魚重量為0.65 kg，檢出丁香酚為0.043 mg·kg-1，說明丁香酚殘留量與魚體本身品種和個(gè)體大小有關(guān)，隨著魚體增大，其耗氧量也隨之增加，魚用麻醉劑檢出量也隨之增加。

圖3 陽性鯽魚樣品SIM 模式下質(zhì)譜圖

影響丁香酚代謝殘留的因素主要是魚的品種、個(gè)體大小以及不同的給藥方式，其他影響因素有溫度、濕度、鹽度、pH 值等。有研究表明，提升水溫能夠很好地控制麻醉和復(fù)蘇時(shí)間，使水產(chǎn)品的代謝率得到顯著提升[4-6]。

2.2 市售麻醉劑結(jié)果分析

對6 種采購的魚用麻醉劑進(jìn)行質(zhì)譜掃描并和NIST庫比對，其匹配度最高的化合物都為丁香酚（圖4）。

圖4 1 μg·mL-1“漁夫?qū)殹甭樽韯┵|(zhì)譜圖

2.3 丁香酚對鯽魚的麻醉效果觀察及殘留消除研究

丁香酚對魚的麻醉給藥實(shí)驗(yàn)表明，低濃度的麻醉和蘇醒耗時(shí)長，高濃度麻醉和蘇醒耗時(shí)短，復(fù)蘇率均為100%，且48 h 存活率依舊不變。給藥復(fù)蘇后的鯽魚與空白對照組比較而言，魚體本身無肉眼可見變化，但活力相較于空白對照魚明顯變?nèi)?，魚體黏液減少；魚鱗明顯變松，內(nèi)臟顏色變深。高劑量組可能因麻醉效果快、在藥水中浸泡時(shí)間短，內(nèi)臟顏色相較于低劑量組略淺，但給藥組總體比空白組內(nèi)臟顏色加深，結(jié)構(gòu)上也呈松散狀態(tài)。

不同麻醉方式下丁香酚在鯽魚肉中的殘留情況如圖5 所示。結(jié)果顯示，鯽魚低濃度長時(shí)間麻醉后魚肉中富集丁香酚的最高濃度為31.9 mg·kg-1，高濃度短時(shí)麻醉后魚肉中富集的最高濃度為11.4 mg·kg-1；表明高濃度快速麻醉實(shí)驗(yàn)下鯽魚體內(nèi)丁香酚殘留量低于低濃度長時(shí)間麻醉下的鯽魚。不同濃度的給藥實(shí)驗(yàn)后復(fù)蘇的鯽魚體內(nèi)丁香酚殘留量持續(xù)減少，2～4 h 消除最快。4 h 后殘留消除率明顯降低。低濃度長時(shí)間麻醉實(shí)驗(yàn)組和高濃度短時(shí)麻醉實(shí)驗(yàn)組在清水中復(fù)蘇24 h 后殘留量分別為1.8 mg·kg-1和2.4 mg·kg-1，48 h 后鯽魚體內(nèi)丁香酚殘留量明顯降低且趨于平衡，但最低含量仍有0.078 mg·kg-1。因此，需要全面考量不同的影響因素，為休藥期的設(shè)定提供可靠依據(jù)，持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測市場上水產(chǎn)品麻醉劑的使用。

圖5 不同給藥濃度下丁香酚在鯽魚體內(nèi)殘留情況圖

3 結(jié)論與討論

丁香酚類化合物是市場上常見的魚用麻醉劑的主要成分，由于水產(chǎn)品在運(yùn)輸?shù)倪^程中極易受到水溫、水密度、顛簸或者擁擠等因素的影響，導(dǎo)致耗氧量提升、呼吸代謝加快、二氧化碳排放量升高，使得水產(chǎn)品應(yīng)激、感染、死亡[7-9]。因此，水產(chǎn)市場上常用麻醉?；畹姆绞教岣咚a(chǎn)品的存活率。

丁香酚類化合物在魚中的殘留自消除規(guī)律的研究結(jié)果表明，高濃度短時(shí)麻醉殘留量低且不影響鯽魚的復(fù)蘇率和存活率，建議在實(shí)際運(yùn)輸中選擇高濃度短時(shí)麻醉的方式。高濃度短時(shí)麻醉下，48 h 后丁香酚的殘留含量仍有0.078 mg·kg-1，需要進(jìn)一步研究丁香酚類化合物在鯽魚中的代謝規(guī)律，確定更合理的用藥量、用藥時(shí)間和休藥期。殘留在魚肉中的丁香酚類化合物可能會(huì)危害人體健康，應(yīng)盡快制定相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評估、制定相關(guān)法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，以及相應(yīng)的快檢方法，保障消費(fèi)者的健康。