◎ 張 翠，傅 鵬，林晶潔

（國(guó)檢（青島）檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 青島 266109）

2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》一部明確了阿膠為馬科動(dòng)物驢（Equus asinusL.）的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[1]，具有補(bǔ)血滋陰、潤(rùn)燥、止血的功效。然而近年來(lái)由于供不應(yīng)求，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多用牛皮或豬皮摻假的阿膠，影響阿膠產(chǎn)品的功效和品質(zhì)，損害大眾利益。為此，許多研究人員對(duì)阿膠的鑒別方法進(jìn)行了研究，如氨基酸分析法[2]、超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法結(jié)合主成分分析法[3]、18O 標(biāo)記聯(lián)合高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法[4]、超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[5-6]等，其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法操作簡(jiǎn)便、快速，且靈敏度高。因此，參考《中華人民共和國(guó)藥典》中的方法對(duì)阿膠進(jìn)行酶解，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)阿膠、牛皮膠和豬皮膠3 種膠進(jìn)行鑒別，建立了鑒別阿膠的方法，為阿膠產(chǎn)品品質(zhì)的監(jiān)控提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

阿膠標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；豬皮膠為自制；牛皮膠、阿膠樣品、阿膠棗樣品和阿膠糕樣品均購(gòu)自市場(chǎng)；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶購(gòu)自SIGMA，加50 mmol·L-1乙酸溶液溶解，于-20 ℃冷凍保存，有效期1 年；甲酸、乙酸銨、甲醇均為色譜純；碳酸氫銨為分析純。

LC-MS/MS 1290-6460 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水+5 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B 為甲醇。流動(dòng)相梯度洗脫比例見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫比例表

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；電離模式：正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（Multi Reaction Monitoring，MRM）；干燥氣溫度：350 ℃；干燥器流量：10 L·min-1；霧化氣壓力：40 psi；毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V。分別將每種動(dòng)物膠的酶解液注入儀器，在Q1全掃描模式下選出響應(yīng)較高的母離子；再采用子離子模式，通過(guò)改變碰撞能量，掃描子離子。然后將全掃描模式下找到的母離子和子離子模式下找到的響應(yīng)較高的碎片離子質(zhì)荷比數(shù)據(jù)確定為 MRM 掃描模式所需的離子對(duì)，詳見(jiàn)表2。

表2 阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對(duì)表

1.2.2 前處理過(guò)程

取粉碎樣品0.02 g，置于10 mL 容量瓶中，加入1%碳酸氫銨溶液（pH 值在7～9）8 mL，超聲30 min，加入1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm水相濾膜。取濾液100 μL于進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)襯管中，加入10 μL胰蛋白酶溶液后搖勻，于37 ℃恒溫酶解12 h 后，注入LC-MS/MS 測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對(duì)

分別取阿膠標(biāo)準(zhǔn)品、牛皮膠和豬皮膠經(jīng)前處理得到的酶解液進(jìn)行檢測(cè)。由圖1 可知，阿膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解液只在阿膠特征離子對(duì)（m/z539.8 →612.4）出峰；牛皮膠酶解液只在牛皮膠特征離子對(duì)（m/z641.3 →783.3）出峰；豬皮膠酶解液只在豬皮膠特征離子對(duì)（m/z505.8 →544.3）出峰。3 種膠的特征離子對(duì)出峰時(shí)間各不相同，互不干擾。

圖1 3 種膠酶解液的質(zhì)譜色譜圖

2.2 摻雜模型的建立

為進(jìn)一步驗(yàn)證阿膠、牛皮膠和豬皮膠特征肽的專(zhuān)屬性，分別建立了二元和三元摻雜模型。

2.2.1 二元摻雜模型

將阿膠與牛皮膠混合，比例分別為1 ∶1、1 ∶2，分別按1.2.2 前處理步驟酶解后得到二元摻雜模型的酶解液，注入LC-MS/MS 測(cè)定。由表3 可看出，驢皮阿膠與牛皮膠的摻雜模型均檢測(cè)出牛皮膠和阿膠特征離子對(duì)。摻雜模型中阿膠特征離子對(duì)和牛皮膠特征離子對(duì)的響應(yīng)與摻雜量呈比例關(guān)系。

表3 二元摻雜模型牛皮膠和阿膠特征離子檢測(cè)結(jié)果表

2.2.2 三元摻雜模型

按阿膠、牛皮膠、豬皮膠摻雜比例為1 ∶1 ∶4，將3 種膠混合后按1.2.2 前處理步驟酶解，得到三元摻雜模型的酶解液注入LC-MS/MS 測(cè)定。結(jié)果顯示，阿膠、牛皮膠、豬皮膠三元摻雜模型檢測(cè)出了阿膠、牛皮膠和豬皮膠的特征離子對(duì)，出峰時(shí)間分別為1.433 min、1.338 min、1.076 min，互不干擾。

綜上所述，本方法專(zhuān)屬性良好，可用于混合膠的組成分析。

2.3 阿膠產(chǎn)品的檢測(cè)

為驗(yàn)證該鑒別方法對(duì)阿膠產(chǎn)品的適用性，將3 種市售阿膠、阿膠棗和阿膠糕按1.2.2 前處理步驟提取、酶解后檢測(cè)（阿膠棗和阿膠糕考慮其添加量適當(dāng)增大稱(chēng)樣量）。表4 結(jié)果顯示，其中兩種阿膠只檢測(cè)出牛皮膠特征離子對(duì)，在阿膠和豬皮膠特征離子對(duì)處未出峰，可能為牛皮膠；有一款阿膠、阿膠棗和阿膠糕均只檢測(cè)出阿膠特征離子對(duì)，在牛皮膠和豬皮膠特征離子對(duì)處未出峰，因此推斷為真正的阿膠產(chǎn)品。

表4 各阿膠產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究采用胰蛋白酶酶解阿膠、牛皮膠和豬皮膠，通過(guò)比較這3 種酶解產(chǎn)物特征多肽的差異識(shí)別出不同動(dòng)物來(lái)源（阿膠、牛皮膠和豬皮膠）的酶解產(chǎn)物的特征離子對(duì)，該方法具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。通過(guò)建立阿膠、牛皮膠和豬皮膠摻雜模型，證明該方法可以用于混合膠的組成和鑒別分析。本研究建立的通過(guò)分析特征離子對(duì)追溯阿膠產(chǎn)品動(dòng)物來(lái)源的方法，為阿膠產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)控和鑒別提供了技術(shù)性支持。