◎ 鐘 燦，勞 嘉，周 馨，賀 煒，劉傳義，張水寒

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥資源研究所，湖南 長沙 410013；2.綠之韻生物工程集團有限公司，湖南 長沙 410329；3.湖南神舟中藥飲片有限公司，湖南 張家界 427200）

黃精（Polygonati rhizoma）為百合科黃精屬植物滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）的根莖，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源。研究發(fā)現，黃精中含有多種化學成分，主要包括多糖、甾體皂苷、三萜、生物堿、木脂素、黃酮、植物甾醇及揮發(fā)油等，其中多糖和甾體皂苷類成分在黃精中含量較高，為其主要藥效成分[1]，具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、降血糖血脂、提高免疫力和抗氧化等功效[2]。目前，市場上黃精的主要產品形式是蒸制之后的黃精飲片[3]或者黃精超微粉，常通過燉煮或沖泡食用，產品形式單一、攜帶不方便。酵素是以植物和發(fā)酵菌共同作用產生的一種新型飲料，受到消費者的青睞[4]，對藥食同源藥材的發(fā)酵也受到越來越多學者的關注。課題組前期基于發(fā)酵動力學初步研制了黃精酵素[5]，結果發(fā)現添加植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵的黃精酵素口感較好，有濃郁的黃精氣味。

益生菌具有抑制腸道病原菌、降血脂、降血糖等功效[6]，被廣泛應用于發(fā)酵產品。近年來，越來越多的中草藥通過發(fā)酵方式提高其主要活性物質的含量[7]。植物乳桿菌是人體的益生菌，擁有大量的碳水化合物水解酶和糖基轉移酶等酶系[8]，能起到改善食品風味、改變食品成分等作用，但其生長受到溫度、pH 值和營養(yǎng)成分等多種外在因素的影響[9]。黃精由于其功效和口感佳有學者對黃精發(fā)酵工藝進行研究[10]，金劍等[11]從鮮黃精發(fā)酵體系中分離獲得了植物乳桿菌；WANG等[12]發(fā)現與厭氧條件下相比，有氧條件下發(fā)酵液中氨基酸等化合物的含量顯著上升。然而在黑暗靜止的條件下，用單一植物乳桿菌發(fā)酵蒸制黃精水提液的工藝鮮見報道。

本研究利用植物乳桿菌發(fā)酵蒸制黃精水提液，以乳酸菌菌落數和液體pH 值動態(tài)變化確定植物乳桿菌發(fā)酵黃精的適宜天數，并以溫度、起始pH 值和蔗糖添加量為主要影響因素確定最佳發(fā)酵工藝，并研究黃精發(fā)酵液中活性物質的變化情況，為黃精酵素的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒸制黃精，安化縣嘉沃種養(yǎng)專業(yè)合作社；黃精水提液，實驗室自制；凍干型植物乳桿菌粉，山東中科嘉億生物工程有限公司；無菌水，實驗室自制；氫氧化鈉，湖南匯虹試劑有限公司；苯酚，天津市恒興化學試劑制造有限公司；濃硫酸，湖南匯虹試劑有限公司；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉，上海精析化工科技有限公司；福林酚，上海聯邁生物工程有限公司。

1.2 植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

①黃精水提液制備。蒸制黃精按照1 ∶10 倍水浸泡2 h，微沸提取2 h，用200 目過濾布過濾，高溫高壓滅菌后備用。②植物乳桿菌黃精發(fā)酵液制備。每100 mL 黃精水提液添加植物乳桿菌粉0.10 g，置于適宜溫度下，避光發(fā)酵。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵時間對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

將植物乳桿菌黃精混合液置于31 ℃下避光發(fā)酵，分別于0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和7 d 采集樣品檢測其植物乳桿菌菌落數、pH 值的變化情況，確定黃精水提液中植物乳桿菌的生長對數期。

1.3.2 初始pH 值對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

在考察發(fā)酵天數的基礎上，分別用NaOH 和HCl 將植物乳桿菌黃精混合液初始pH 值調為4、5、6、7 和8，在溫度為31 ℃、蔗糖濃度為30 g·L-1條件下發(fā)酵，考察黃精水提液初始pH 值對植物乳桿菌菌落生長的影響。

1.3.3 發(fā)酵溫度對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

在考察發(fā)酵天數的基礎上，將植物乳桿菌黃精混合液分別置于19 ℃、25 ℃、31 ℃、37 ℃和43 ℃下發(fā)酵，發(fā)酵液起始pH 值為7.0，蔗糖濃度為30 g·L-1，考察溫度對植物乳桿菌菌落生長的影響。

1.3.4 蔗糖濃度對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

在考察發(fā)酵天數的基礎上，在植物乳桿菌黃精混合液中分別添加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖，以不添加任何碳源的植物乳桿菌黃精混合液作為對照，發(fā)酵液起始pH 值為7.0，發(fā)酵溫度為31 ℃，考察碳源對植物乳桿菌菌落生長的影響。

1.4 測定項目

1.4.1 植物乳桿菌生長的測定

采用平板稀釋法測定樣品中活菌落數。

1.4.2 pH 值測定

采用PHS-3E 酸度計對發(fā)酵液進行pH 值測定，pH 計校準后用蒸餾水沖洗電極，將電極放入待測的發(fā)酵原液中，待屏幕上顯示的pH 值穩(wěn)定后，記錄pH 值。

1.4.3 多酚的測定

采用福林酚比色法測定樣品中的多酚含量，標準曲線為y=126.88x+0.038，式中y為吸光度，x為沒食子酸含量（mg），根據取樣體積數計算溶液中多酚濃度。

1.4.4 總酸含量的測定

參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB 12456ü 2021），采用酸堿滴定法測定樣品溶液中的總酸，以乳酸計。

1.4.5 總多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定液體中的總多糖，標準曲線為y=10.64x+0.133 3，其中y為吸光度，x為多糖的含量（mg），根據取樣體積數計算溶液中的多糖濃度。

1.4.6 抗氧化活性測定

FRAP 法：取0.2 mL 樣品加2.8 mL 預熱至37 ℃的FRAP 試劑，反應30 min 后在595 nm 波長處測其吸光度，以無水乙醇作為空白對照，測其吸光度，計算每毫升樣品的trolox 當量。

1.5 數據處理

每個樣品平行測定3 次，采用Excel 進行差異顯著性（P＜0.01）分析，使用OriginPro 9.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵黃精提取液發(fā)酵時間的考察

將黃精提取液滅菌后，在無菌條件下用無菌NaOH 溶液將初始pH 值調至7 左右，加入植物乳桿菌菌液讓其起始菌落數在7 lgCFU·mL-1左右，每隔24 h 采集樣品對其pH 值和菌落數進行檢測。由圖1可知，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液pH 值持續(xù)下降，其中第1 天到第2 天降幅最大，從6.82f 0.07 直接降到了5.03f 0.06，第2 天以后pH 值降幅比較緩慢，特別是第5 天到第7 天變化幅度僅為0.04。植物乳桿菌菌落則隨著發(fā)酵的進行，菌落數先增加后下降，在第2 天達到最大值（9.86f 0.24）lgCFU·mL-1，第3 天和第4 天植物乳桿菌數量急劇下降，到第6 天菌落數與起始菌落數接近，第7 天菌落數降至初始菌落數以下。第7 天以后發(fā)酵液pH 值和菌落數基本無變化。因此從菌落生長情況來看，第2 天是黃精水提液中乳酸菌生長的對數期，因此選擇第2 天考察其他單因素對黃精水提取液中植物乳桿菌生長的影響。

圖1 植物乳桿菌發(fā)酵黃精提取液發(fā)酵天數的確定圖

2.2 起始pH 值對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

起始pH 值為7 時菌落數最高達（9.86f 0.11）lgCFU·mL-1，起始pH 值為4 時菌落數最低僅為（8.58f 0.07）lgCFU·mL-1。隨著發(fā)酵的進行，pH 值變化則與黃精水提液的起始pH 值有一定的相關性，發(fā)現起始pH 值越高，發(fā)酵液第2 天的pH 值越高，但是起始pH 值為4～7 時，發(fā)酵液第2 天的pH 值差異不大（圖2）。從黃精水提液乳酸菌的生長情況來看，起始pH 值為7 時更適合乳酸菌的生長。

圖2 起始pH 值對發(fā)酵液中植物乳桿菌菌落數和pH 值的影響圖

2.3 發(fā)酵溫度對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

溫度是影響植物乳桿菌生長的關鍵因素之一，將加入植物乳桿菌的黃精提取液置于不同溫度條件下，考察溫度對其發(fā)酵過程菌落數和pH 值的影響。結果發(fā)現，31 ℃條件下植物乳桿菌菌落數最高為（9.99f 0.15）lgCFU·mL-1，其次是37 ℃菌落數 為（9.82f 0.12）lgCFU·mL-1，25 ℃是 菌落數 為（9.70f 0.10）lgCFU·mL-1，43 ℃高溫不適合乳酸菌的生長。發(fā)酵液pH 值在31 ℃時下降最多，25 ℃、31 ℃和37 ℃下發(fā)酵液中pH 值基本一致，19 ℃和43 ℃時下降較少，說明19 ℃和43 ℃條件下乳酸菌生長不旺盛，產酸能力明顯不如其他溫度條件下（圖3）。因此，31 ℃適合黃精水提液中乳酸菌的生長。

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中植物乳桿菌菌落數和pH 值的影響圖

2.4 蔗糖濃度對黃精發(fā)酵液中菌落數和pH 值的影響

蔗糖是為植物乳桿菌提供生長所需的碳源。結果發(fā)現，蔗糖能明顯提高發(fā)酵液中植物乳桿菌的菌落 數，添 加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖的情況下菌落數在發(fā)酵第2 d 分別為（9.94f 0.12）lgCFU·mL-1和（9.81f 0.16）lgCFU·mL-1，沒有添加蔗糖的對照組中發(fā)酵液中菌落數為（8.93f 0.06）lgCFU·mL-1。蔗糖濃度越高，黃精發(fā)酵液pH 值下降越快，但添加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖菌落數并無明顯差異（圖4）。因此黃精水提液中蔗糖濃度為30 g·L-1時比較適合乳酸菌的生長。

圖4 蔗糖濃度對發(fā)酵液中植物乳桿菌菌落數和pH 值的影響圖

2.5 最佳發(fā)酵條件下黃精酵素活性物質檢測

在上述實驗基礎上，以植物乳桿菌生長量最高的水平為發(fā)酵黃精提取液的最佳工藝條件，即起始pH值為7，發(fā)酵溫度為31 ℃，蔗糖濃度為30 g·L-1。在此發(fā)酵條件下進行3 次平行試驗，以黃精水提取液作為對照樣品。由圖5 可知，黃精提取液和發(fā)酵液中的多酚含量差異不大，分別為（0.60f 0.082 0）mg·mL-1和（0.68f 0.036 5）mg·mL-1。發(fā)酵液中多糖含量為（57.33f 1.199 0）mg·mL-1，是水提液（47.07f 1.681 6）mg·mL-1的1.22倍。發(fā)酵液中總酸含量為（2.31f 0.187 4）mg·mL-1，是水提液（1.13f 0.371 7）mg·mL-1的2.04 倍。

圖5 黃精提取液和發(fā)酵液中多酚（A）、多糖（B）和總酸（C）含量測定以及抗氧化活性研究（D）圖

通過差異顯著分析發(fā)現，與水提取液相比，發(fā)酵液中多酚含量變化不顯著，而多糖和總酸含量顯著提高。且經過植物乳桿菌發(fā)酵后黃精酵素中的FRAP 抗氧化活性為（7.04f 0.265 1）mg·Trolox·mL-1，而黃精水提液FRAP 抗氧化活性為（4.61f 0.304 4）mg·Trolox·mL-1，發(fā)酵后黃精酵素抗氧活性顯著提高，是黃精水提液的1.53 倍。

3 結論與討論

本研究以蒸制黃精水提液為原料，以單一的植物乳桿菌作為發(fā)酵菌在靜止黑暗條件下發(fā)酵，分別基于溫度、起始pH 值和蔗糖添加量等探索植物乳桿菌發(fā)酵黃精水提液的最佳工藝，并研究其活性成分的變化。結果發(fā)現，黃精水提液添加30 g·L-1的蔗糖，發(fā)酵溫度31 ℃，起始pH 值為7.0 較適合植物乳桿菌生長。在此發(fā)酵條件下，黃精提取液和發(fā)酵液中的多酚含量差異不大，但發(fā)酵液中多糖含量為水提液的1.22 倍，總酸含量為水提液的2.04 倍。由此可知，發(fā)酵過程能顯著提高黃精酵素中多糖和總酸的含量，這可能是黃精酵素酸甜口感的來源。不僅如此，對比黃精水提液和發(fā)酵液的抗氧化活性發(fā)現，發(fā)酵液的抗氧化活性是黃精水提液的1.53 倍，發(fā)酵后抗氧化活性明顯提高，諸多研究表明植物乳桿菌發(fā)酵其他藥材其抗氧化能力隨著發(fā)酵過程而逐漸增加[13-14]。這為黃精新型的開發(fā)和產業(yè)鏈的延伸提供了基礎。