馮 暄 張慶華 王 興 何 靜 梁濟(jì)慈 賈春暘 藺朋武 朱韶華 郝勝菊

（甘肅省醫(yī)學(xué)遺傳中心 甘肅省出生缺陷與罕見病臨床研究中心 甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

目前，利用無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)檢測(cè)胎兒染色體非整倍體異常已成為臨床產(chǎn)前篩查的重要方法。1997年，LO等[1]首次報(bào)道在孕婦血液中含有胎兒游離DNA（cell-free fatal DNA，cffDNA）片段，使得基于cffDNA篩查胎兒染色體非整倍體成為可能。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，檢測(cè)染色體微缺失/微重復(fù)的擴(kuò)展性無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)（expanded non-invasive prenatal testing，NIPT-plus）被引入新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室[2]。染色體的微缺失/微重復(fù)又稱為拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），其臨床發(fā)生率為1.6%～1.7%，高于唐氏綜合征，且與孕婦年齡無(wú)關(guān)，可導(dǎo)致染色體微缺失/微重復(fù)綜合征（<5 Mb），可能造成患兒身體不同程度殘疾、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或智力受損等，患兒可長(zhǎng)期存活，且大多有生育能力[3]。在全部出生缺陷中，約有19%的先天性缺陷是由染色體異常導(dǎo)致的，其中CNV是重要的致病因素[4]。由于染色體微陳列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測(cè)成本較高，大部分患者僅選擇傳統(tǒng)的羊水核型分析，造成大量攜帶CNV的胎兒漏檢。因此，評(píng)估NIPT-plus篩查染色體微缺失/微重復(fù)的臨床效能具有重要的意義。本研究擬對(duì)NIPT-plus篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦采用介入性產(chǎn)前診斷[低深度全基因組測(cè)序（copy number variation sequencing，CNVseq）和染色體核型分析]確診，以明確NIPT-plus的檢測(cè)效能，探討NIPT-plus在篩查胎兒染色體微缺失/微重復(fù)中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017—2018年在甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心進(jìn)行NIPT-plus檢測(cè)的孕婦10 187例，年齡（31.71±5.0）歲，孕周（18.0±3.6）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）血清學(xué)產(chǎn)前篩查示21-三體綜合征、18-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)；2）高齡妊娠（預(yù)產(chǎn)年齡≥35歲）；3）B超軟指標(biāo)異常；4）錯(cuò)過(guò)唐氏綜合征篩查（簡(jiǎn)稱唐篩）檢測(cè)時(shí)間；5）因其他原因要求行NIPT。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）雙胎或多胎妊娠；2）1年內(nèi)接受過(guò)異體輸血；3）1年內(nèi)接受過(guò)免疫治療、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療；4）孕期患有實(shí)體腫瘤；5）采血當(dāng)日體重>100 kg。本研究通過(guò)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018院倫審研第30號(hào)），所有研究對(duì)象均知情同意，NIPT結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)行遺傳咨詢并告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后簽署侵入性產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

血漿游離DNA提取試劑盒（磁珠法）、高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建DNA純化試劑盒和無(wú)創(chuàng)胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自杭州貝瑞和康公司。文庫(kù)定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)KAPA公司），T100 PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），Stepone plus熒光定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司），NextSeq CN500高通量測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

1.2.2 NIPT-plus檢測(cè)

采集所有研究對(duì)象外周血10 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用兩步離心法去除殘余白細(xì)胞和細(xì)胞碎片。采用血漿游離DNA提取試劑盒提取cffDNA，cffDNA濃度應(yīng)>3%。通過(guò)DNA末端修復(fù)、通用測(cè)序引物和樣本識(shí)別標(biāo)簽連接、文庫(kù)構(gòu)建產(chǎn)物純化的方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建后的文庫(kù)濃度>0.2 ng/mg。將混合的文庫(kù)在NextSeq CN500高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)與人類參考基因組hg19序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)RUPA快速分析流程（杭州貝瑞和康公司），檢測(cè)胎兒染色體CNV。

1.2.3 羊水采集和染色體核型分析

在B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，羊水樣本送細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室，按標(biāo)準(zhǔn)操作方法和步驟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用原位收獲法收獲染色體，G顯帶，在顯微鏡下進(jìn)行染色體核型分析。

1.2.4 羊水CNV-seq檢測(cè)

按照樣本DNA提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取羊水樣本DNA，對(duì)獲得的DNA進(jìn)行純化。按照染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，打斷DNA，末端修復(fù)，加入polyA和特定接頭，純化。采用NextSeq CN500 高通量測(cè)序儀對(duì)純化、質(zhì)檢后的DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。采用科諾安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)和分析，獲得目標(biāo)染色體的Z值和全部>100 kb 的染色體拷貝數(shù)變異。

1.2.5 外周血CNV-seq檢測(cè)

采集所有NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的靜脈血，進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)（檢測(cè)方法同羊水CNVseq），以驗(yàn)證是否為母體CNV異常導(dǎo)致NIPTplus結(jié)果假陽(yáng)性。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

測(cè)序所得的讀長(zhǎng)與人類參考基因組hgl9序列進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)檢索Decipher數(shù)據(jù)庫(kù)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)和UCSC基因組瀏覽器、Clinvar數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)檢測(cè)到的CNV的致病性進(jìn)行評(píng)估。參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南，將檢出的CNV分為5個(gè)級(jí)別：明確致病性、可能致病性、臨床意義未明、良性、可能良性。

1.2.7 隨訪

采用電話隨訪方式對(duì)所有受檢孕婦隨訪至分娩后3個(gè)月，隨訪內(nèi)容包括產(chǎn)前診斷情況、孕期產(chǎn)檢監(jiān)測(cè)結(jié)果、妊娠結(jié)局和新生兒出生缺陷情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用線性相關(guān)分析評(píng)估CNV發(fā)生與孕婦年齡的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10 187例孕婦一般資料分析

10 187例孕婦中，有76例（0.75%）因血漿cffDNA濃度不達(dá)標(biāo)而重新采樣。采用NIPTplus從10 187例孕婦中篩查出高風(fēng)險(xiǎn)孕婦164例（1.61%），其余10 023例孕婦為NIPT-plus低風(fēng)險(xiǎn)。10 187例孕婦一般資料和NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦分布見表1。

表1 10 187例孕婦一般資料和NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦分布

2.2 NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦篩查結(jié)果

164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，21-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)32例、18-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)11例、13-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)9例、47，XXX高風(fēng)險(xiǎn)14例、47，XXY高風(fēng)險(xiǎn)10例、47，XYY高風(fēng)險(xiǎn)5例、45，XO高風(fēng)險(xiǎn)47例、CNV高風(fēng)險(xiǎn)33例。

2.3 NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦羊水樣本CNV-seq檢測(cè)結(jié)果

164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，有131例接受CNV-seq檢測(cè)，共確診59例，假陽(yáng)性72例（0.71%，72/10 187）。NIPT-plus篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為91.67%、71.43%、25.00%，篩查性染色體非整倍體異常和CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為27.87%、39.40%。見表2。

表2 164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦CNV-seq檢測(cè)結(jié)果

2.4 NIPT-plus對(duì)CNV的檢出率

164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，胎兒染色體CNV異常33例，CNV-seq確診13例，假陽(yáng)性15例，其中有5例（病例1、12、13、17、22）由于母體CNV異常而導(dǎo)致假陽(yáng)性。33例胎兒染色體CNV異常孕婦診斷結(jié)果見表3。

表3 33例胎兒染色體CNV異常孕婦診斷結(jié)果

2.5 NIPT-plus檢測(cè)染色體非整倍體異常和CNV的性能

NIPT-plus篩查胎兒21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為91.67%、71.43%和25.00%，特異性分別為99.98%、99.98%、99.94%，敏感性均為100.00%。

對(duì)于性染色體非整倍體異常，NIPT-plus篩查超雄綜合征（47，XXY）的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、敏感性和特異性均為100.00%；篩查超雌綜合征（47，XXX）和克氏綜合征（47，XXY）的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為44.44%，敏感性為100.00%，特異性為99.95%；篩查特納綜合征的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最低（12.50%），假陽(yáng)性率為0.34%，敏感性為100.00%，特異性為99.66%。對(duì)于染色體拷貝數(shù)變異，NIPT-plus篩查5～10 Mb缺失/重復(fù)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、敏感性和特異性均為100.00%；篩查>10 Mb的缺失/重復(fù)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為62.50%，敏感性為100.00%，特異性為99.97%；篩查<5 Mb的缺失/重復(fù)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為42.86%，敏感性為90.00%，特異性為99.88%。見表4。

表4 NIPT-plus檢測(cè)CNV的性能

2.6 NIPT-plus篩查不同年齡孕婦CNV的效能

CNV的發(fā)生與孕婦年齡無(wú)線性關(guān)系（P>0.05）。孕婦年齡對(duì)NIPT-plus篩查CNV的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、特異性、敏感性均無(wú)影響。見表5。

表5 NIPT-plus篩查不同年齡孕婦CNV的效能

2.7 隨訪結(jié)果

2.7.1 NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)孕婦隨訪結(jié)果

10 023例NIPT-plus低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，成功完成隨訪8 810例，隨訪有效率為87.9%，其中8 685例孕婦順利分娩，新生兒各項(xiàng)體檢指標(biāo)均正常；另125例因后期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒畸形或因死胎而引產(chǎn)。164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，有131例行產(chǎn)前診斷，最終確診陽(yáng)性59例，其中11例分娩（5例確診為胎兒性染色體非整倍體異常、6例確診為胎兒CNV異常）后，新生兒未發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯異常；4例確診為胎兒性染色體非整倍體異常的孕婦發(fā)生孕中期流產(chǎn)；其余44例陽(yáng)性孕婦均選擇終止妊娠。

2.7.2 拒絕或未行介入性產(chǎn)前診斷孕婦的隨訪結(jié)果

164例NIPT-plus高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，有33例拒絕或未行介入性產(chǎn)前診斷。隨訪結(jié)果顯示，13例提示21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，有4例自然流產(chǎn)，5例直接引產(chǎn)，4例拒絕隨訪；15例提示性染色體非整倍體異常高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中，有9例繼續(xù)妊娠，分娩后新生兒未行染色體核型分析，家屬自述未見明顯異常，2例直接引產(chǎn)，4例拒絕隨訪；5例提示CNV異常高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中，有1例NIPT-plus結(jié)果與孕婦本人染色體結(jié)果一致，繼續(xù)妊娠，分娩后新生兒無(wú)明顯異常，1例直接引產(chǎn)，3例拒絕隨訪。

3 討論

近年來(lái)，隨著遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)水平的不斷提高和人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息的不斷更新和完善，染色體CNV的臨床意義得以被證實(shí)。NIPT憑借其高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、高敏感性和高特異性等優(yōu)勢(shì)，已成為篩查21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的常規(guī)技術(shù)。除了染色體數(shù)目異常之外，致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variant，pCNV）也是出生缺陷重要的遺傳學(xué)因素。有研究結(jié)果顯示，胎兒攜帶pCNV的比例可高達(dá)1.6%～1.7%，遠(yuǎn)高于21-三體綜合征（0.5%～0.6%）[5-6]。因此，開展無(wú)創(chuàng)pCNV篩查對(duì)預(yù)防出生缺陷有重要意義。

除21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征外，NIPT-plus還可篩查出其他常染色體異常、性染色體異常和pCNV的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦[2，7-8]。有研究結(jié)果顯示，對(duì)于片段>6 Mb的pCNV，NIPT-plus的篩查效率可達(dá)83.0%～90.9%[9-10]，且隨著cffDNA濃度的富集、測(cè)序深度的增加和生物信息學(xué)分析流程的進(jìn)一步優(yōu)化，對(duì)如DiGeorge綜合征等3 Mb左右小片段的pCNV的篩查陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)92.9%[2]。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)、國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)均指出，在做好知情同意，明確待檢測(cè)pCNV的檢出率、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)的前提下，可以針對(duì)臨床意義明確、表型嚴(yán)重的pCNV進(jìn)行篩查[11-12]。雖然美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)關(guān)于篩查胎兒染色體異常的臨床聲明因臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)不充分而暫不推薦開展pCNV篩查，但同時(shí)指出，如果NIPT-plus發(fā)現(xiàn)pCNV，應(yīng)進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證[13]。因此，在臨床前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分、各項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)明確的前提下，對(duì)發(fā)病率高、致病性嚴(yán)重的pCNV可采用NIPT-plus篩查。

目前，NIPT-plus已有多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，各個(gè)技術(shù)平臺(tái)的測(cè)序原理不一致，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也不一致，篩查結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的差異。另外，相同的技術(shù)平臺(tái)，如參考的人類基因組序列版本不一致也會(huì)得出不一致的結(jié)果。本研究采用NextCN500高通量測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序深度為0.2×～0.3×，每份樣本的數(shù)據(jù)量為18 Mb左右，唯一比對(duì)序列≥10 Mb。將該平臺(tái)檢出的CNV按發(fā)生的大小可分為<5 Mb、5～10 Mb、>10 Mb共3個(gè)類別，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為42.86%、100.00%、62.50%，總陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為68.50%，對(duì)<5 Mb的CNV檢測(cè)性能最低。有學(xué)者報(bào)道了一種使用350萬(wàn)Reads識(shí)別71.8%的CNV的方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)CNV<5 Mb時(shí)，檢測(cè)性能會(huì)下降至41.2%[14]。LO等[9]使用400～600萬(wàn)Reads分析3～42 Mb的CNV，準(zhǔn)確率為64.5%。SRINIVASAN等[15]的研究結(jié)果顯示，測(cè)序深度越深、cffDNA濃度越高，可檢測(cè)到的畸變片段越小。由此可見，測(cè)序深度的降低在一定程度上限制了對(duì)小片段CNV的檢出。

本研究結(jié)果顯示，NIPT-plus共篩查出CNV高風(fēng)險(xiǎn)孕婦33例，其中有5例拒絕羊水穿刺，有28例行羊水穿刺和外周血檢測(cè)，采用CNVseq確診。該28例孕婦中，有15例經(jīng)CNV-seq驗(yàn)證為假陽(yáng)性，其中5例（33.3%）CNV來(lái)源于母體，是由母體CNV導(dǎo)致的假陽(yáng)性。由此可見，母體CNV異常是NIPT-plus檢測(cè)假陽(yáng)性的一個(gè)重要原因。本研究通過(guò)CNV-seq檢測(cè)共確診13例，經(jīng)父母來(lái)源驗(yàn)證，結(jié)果顯示2、3、5、7、8、9號(hào)樣本的變異均來(lái)自父母一方，該6例孕婦經(jīng)遺傳咨詢后選擇繼續(xù)妊娠，常規(guī)產(chǎn)檢。本研究13例陽(yáng)性樣本中，有7例（53.8%）CNV變異證實(shí)為新發(fā)變異，依據(jù)ACMG指南進(jìn)行致病性分析，確定均為致病性變異，其中1例診斷為DiGeorge綜合征，另6例均為>5 Mb的變異，可導(dǎo)致臨床表型異常，如嚴(yán)重的畸形或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。因此，這7例孕婦均選擇終止妊娠。由于NIPT-plus檢測(cè)的是來(lái)源于胎盤的游離DNA，受疾病發(fā)生率、假陽(yáng)性率、cffDNA濃度、測(cè)序深度、微缺失/微重復(fù)片段大小等多種因素的影響[14-16]，NIPT-plus可篩查出>3 Mb的CNV，但仍有很多pCNV不能被有效檢出[2]，需要在檢測(cè)前充分告知。同時(shí)，NIPT-plus也可篩查出大量臨床意義未明的CNV[17]或?qū)μ河绊懖粐?yán)重的pCNV，這類CNV均不建議納入篩查報(bào)告[18]。CNV所致的疾病大多屬于新發(fā)突變導(dǎo)致的零散發(fā)病，建議結(jié)合CNV大小、致病性、疾病嚴(yán)重程度、是否外顯不全等情況進(jìn)行綜合分析，否則可能會(huì)導(dǎo)致孕婦不必要的孕期焦慮，同時(shí)增加診斷負(fù)擔(dān)，為產(chǎn)前遺傳咨詢帶來(lái)困擾。

綜上所述，NIPT-plus可用于染色體非整倍體、染色體微缺失/微重復(fù)、性染色體異常等的篩查，彌補(bǔ)了染色體核型分析的不足。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步提高NIPT-plus在檢測(cè)染色體微缺失/微重復(fù)中的特異性、準(zhǔn)確性和敏感性。