郭依萍， 曹國(guó)強(qiáng) ， 任道平

（黑龍江金象生化有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150000）

玉米在淀粉的深加工過程中會(huì)產(chǎn)生30%左右的副產(chǎn)品，這些副產(chǎn)品中包括玉米皮、玉米蛋白粉、玉米漿等（耿春銀等，2005；蔣瑞芬，1994）。 玉米皮是副產(chǎn)品中含量最高的， 占比高達(dá)干基的10% ～14%，主要含量為蛋白質(zhì)、纖維素、葡萄糖以及其他一些糖類（李鳳英，1995）。其中膳食纖維豐富，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量高，添加到飼料中不利于被動(dòng)物吸收， 通常采取微生物發(fā)酵的方法將其轉(zhuǎn)化為有益的小分子物質(zhì)（閆星月等，2022）。目前主要應(yīng)用于發(fā)酵的菌種為乳酸菌、 酵母菌和芽孢桿菌三大類（李楊，2012）。乳酸菌可降低蛋白酶抑制劑的含量，降低蛋白質(zhì)，釋放出游離的氨基酸（Lim等，2019）， 可提高多種氨基酸的含量 （Zhao 等，2017）， 減少副產(chǎn)品中的質(zhì)酸含量 （Licandro 等，2019）和非淀粉多糖含量（Feng 等，2020）。 酵母菌可以使副產(chǎn)品半纖維素含量有效減少（Decimo等，2017）， 總酚的含量增加并促進(jìn)異黃酮的生物轉(zhuǎn)化（Santos 等，2018）。芽孢桿菌可使副產(chǎn)品中蛋白酶抑制劑的含量降低70.3%（Yang 等，2019）。酶制劑發(fā)酵可以降解玉米副產(chǎn)品中的脂肪酸、纖維素及碳水化合物， 使副產(chǎn)品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低，還會(huì)增加維生素含量（聶利波等，2018）。本試驗(yàn)研究復(fù)合菌種協(xié)同酶制劑發(fā)酵副產(chǎn)品時(shí)的優(yōu)良菌種與合適的酶制劑及發(fā)酵條件， 以期優(yōu)化菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米副產(chǎn)物的工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用的玉米副產(chǎn)品飼料作為發(fā)酵底物， 由北安象嶼金谷生化科技有限公司提供。 植物乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母，含量100 億CFU/g。 纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶，含量20000 U/g。 試驗(yàn)所用的菌劑和酶制劑均購(gòu)自昕大洋內(nèi)丘生物科技有限公司。MRS 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)等試驗(yàn)試劑購(gòu)自北京挑戰(zhàn)集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌的篩選 將菌株分別接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 平板計(jì)數(shù)活菌數(shù)達(dá)到1×108CFU/mL，獲得種子液。 將菌株按照不同比例混合后以10%（V/m）的比例接種到發(fā)酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發(fā)酵5 d。 測(cè)量pH 和還原糖含量。

1.2.2 酶制劑的篩選 將1.2.1 得到的最佳菌種混合比例按照10%（V/m）比例接種到發(fā)酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發(fā)酵5 d，添加酶制劑的總量150 U/g，分別進(jìn)行單酶和混合酶發(fā)酵試驗(yàn)。

將1.2.1 得到的最佳菌種混合比例按照10%（V/m）比例接種到發(fā)酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發(fā)酵5 d，將酶制劑按照確定的比例混合，設(shè)置酶制劑添加量梯度為0、50、100、150、200、300 U/g進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，確定酶制劑最佳添加量。

1.2.3 正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件 菌酶混合比例發(fā)酵底物，選取A 發(fā)酵溫度，B 料水比，C 接菌量三個(gè)因素設(shè)計(jì)3 因素3 水平正交試驗(yàn) （表1），發(fā)酵后取樣用仿生消化儀檢測(cè)物質(zhì)消化率，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得出最適合玉米副產(chǎn)品的發(fā)酵條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵處理玉米副產(chǎn)品底物 將菌劑和酶制劑按照上述得出的最佳比例混合，按1.2.3 中的得到的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，取樣用凱氏定氮法檢測(cè)粗蛋白質(zhì) （CP） 含量， 按照GB 2906-82 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定飼料中的粗脂肪（EE）含量，按照GB/T 6434-2006 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定粗纖維（CF）含量。

1.2.5 還原糖的測(cè)定 在試管內(nèi)按表2 所示依次加入試劑，在540 nm 波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)檢測(cè)，以葡萄糖含量為X軸吸光度為Y軸，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線， 回歸方程為Y=0.7868X-0.0073，R2為0.9993。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)組，用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，單因素試驗(yàn)用單因素ANOVA 檢測(cè)，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選 試驗(yàn)微生物發(fā)酵對(duì)還原糖含量和pH 變化的影響，7# 試驗(yàn)組pH 和還原糖含量變化顯著優(yōu)于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P＜0.05），還原糖含量37.4 mg/g，與1# 對(duì)照組20.3 mg/g 相比大幅提升（表3）。 選定釀酒酵母：植物乳桿菌比例為1∶1 為最佳菌種發(fā)酵組。

表3 不同比例菌劑發(fā)酵對(duì)還原糖含量及pH 的影響

2.2 酶制劑篩選

2.2.1 試驗(yàn)添加酶制劑對(duì)玉米副產(chǎn)品型飼料的發(fā)酵影響 添加酶制劑后還原糖含量明顯增多，pH降低（表4），結(jié)果表明纖維素酶：葡聚糖酶=1∶1 為最佳酶制劑添加比例，此時(shí)還原糖含量40.8 mg/g顯著高于其他試驗(yàn)組及對(duì)照組，pH 4.10 顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

表4 添加單酶和混合酶對(duì)還原糖含量及pH 的影響

2.2.2 試驗(yàn)酶制劑最佳添加總量 當(dāng)酶制劑總量增大時(shí)還原糖的含量也隨著增加，pH 隨著減小（表5）， 當(dāng)添加量達(dá)到200 U/g 時(shí)還原糖含量和pH 較其他試驗(yàn)組有顯著變化（P＜0.05），當(dāng)添加量到300 U/g 時(shí)，與200 U/g 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)差距不顯著（P＞0.05），考慮成本因素，得出酶制劑的最佳添加總量為200 U/g。

表5 酶制劑添加總量對(duì)還原糖含量及pH 的影響

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵條件篩選試驗(yàn) 三個(gè)因素對(duì)玉米副產(chǎn)品發(fā)酵還原糖含量的影響強(qiáng)弱為接菌量、料水比、發(fā)酵溫度（表6）。A2B2C3為最佳方案，還原糖含量達(dá)到45.6 mg/g，即發(fā)酵溫度30 ℃，料水比1∶1.2（g/mL），接菌量12%。由方差分析結(jié)果可知（表7），三個(gè)因素中發(fā)酵溫度和接菌量對(duì)還原糖含量影響顯著（P＜0.05），料水比影響不顯著（P＞0.05）。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果%

2.3.2 試驗(yàn)菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米副產(chǎn)物后營(yíng)養(yǎng)成分變化 試驗(yàn)組的CP 含量提升26.6%，EE 含量提升30.8%，CF 含量減少25.4%， 均產(chǎn)生顯著變化（P＜0.05，表8），說明該發(fā)酵工藝可使玉米副產(chǎn)品型飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量大幅提升。

表8 玉米副產(chǎn)品飼料發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分變化結(jié)果%

3 討論

不同微生物在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物， 故在多菌發(fā)酵時(shí)這些代謝物相互之間會(huì)產(chǎn)生拮抗作用（劉玉輝等，2020），所以應(yīng)根據(jù)不同的發(fā)酵底物來(lái)選擇合適的發(fā)酵菌種。 本研究選擇了飼料可添加菌種進(jìn)行試驗(yàn)， 乳酸菌代謝的酸性物質(zhì)使環(huán)境pH 降低， 可有效抑制其他有害細(xì)菌的生長(zhǎng)（Gareau 等，2010），且乳酸菌的抑菌性會(huì)隨著pH 的降低而逐漸減弱 （張開屏等，2020；Gareau 等，2010），故可通過產(chǎn)酸能力選擇優(yōu)良乳酸菌。 釀酒酵母的粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上，應(yīng)用其發(fā)酵玉米秸稈時(shí)可使粗蛋白質(zhì)含量增加（惠文森等，2011）。玉米副產(chǎn)品飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量較少，添加酵母菌可以改善飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。家畜的胃腸道中含有強(qiáng)酸和高膽鹽， 所以篩選出耐受性強(qiáng)、高生存率的菌種尤為重要。

玉米副產(chǎn)品中含有很多纖維素?zé)o法直接被動(dòng)物吸收，降解會(huì)產(chǎn)生還原糖，供微生物生長(zhǎng)利用，從而導(dǎo)致pH 降低（冉杰，2014）。 pH 下降同時(shí)還原糖含量升高， 說明微生物發(fā)酵時(shí)纖維素得到有效降解。 本研究以pH 和還原糖含量為參考確定混合菌種發(fā)酵的最佳比例，當(dāng)釀酒酵母：植物乳桿菌比例為1∶1 時(shí)發(fā)酵效果最好。

在微生物的發(fā)酵基礎(chǔ)上添加外源酶制劑對(duì)飼料進(jìn)行預(yù)處理，成本低、操作簡(jiǎn)單且易于控制，酶水解的代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)， 對(duì)菌種的發(fā)酵有促進(jìn)效果（Liu 等，2016）。 纖維素酶可以對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行水解， 為飼料提供糖分和其他養(yǎng)分，也可有效降低NDF 的含量（楊志剛等，2002）。木聚糖酶可以有效增加飼料的物質(zhì)轉(zhuǎn)化率（汪儆等，1997）。 葡聚糖酶的添加可以使飼料中粗纖維的消化率明顯改善（李娟等，2014）。以還原糖含量和pH 作為指標(biāo)，設(shè)計(jì)單酶和混合酶發(fā)酵試驗(yàn)，得出最佳酶制劑添加比例為纖維素酶：葡聚糖酶=1∶1。確定最佳混合酶制劑添加比例的基礎(chǔ)上， 設(shè)置添加總量梯度發(fā)酵試驗(yàn)， 得出酶制劑的最佳添加總量為200 U/g。

菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料底物效果可受多種因素影響， 如發(fā)酵溫度、 接種量、 料水比等（Jamal 等，2012）。 發(fā)酵過程中一定程度升溫可加速微生物的生長(zhǎng)，但是當(dāng)溫度增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，會(huì)使酶制劑的酶活降低，反而影響發(fā)酵效果（Yazdi 等，2013）。 接菌量低會(huì)因微生物濃度過低減緩生長(zhǎng)速度，但是接菌量過大，會(huì)加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，而影響代謝物質(zhì)的累積（蘭光群，2020）。 發(fā)酵過程中合適的液體比例也可以維持氧氣交換，營(yíng)造良好的發(fā)酵環(huán)境。 粗纖維、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪是飼料中的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 可將其作為指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證菌酶協(xié)同發(fā)酵效果。

4 結(jié)論

菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米副產(chǎn)品飼料的最佳參數(shù)為釀酒酵母、植物乳桿菌1∶1 添加，纖維素酶、葡聚糖酶1∶1 添加，酶制劑添加量為200 U/g，發(fā)酵溫度30 ℃，料水比1∶1.2（g/mL），接菌量12%。 發(fā)酵玉米副產(chǎn)品型飼料可使粗蛋白質(zhì)含量增加26.6%，粗脂肪含量增加30.8%，粗纖維含量降低25.4%。 本研究認(rèn)為用菌酶協(xié)同的發(fā)酵方式可使飼料中營(yíng)養(yǎng)成分含量有效增加， 為玉米副產(chǎn)品型飼料提供了一種有效發(fā)酵工藝。