苗長瑜 劉東璞 楊曉帆 張輝

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院微生態(tài)-免疫調節(jié)網絡與相關疾病重點實驗室,黑龍江 佳木斯 154000)

肝纖維化最突出的病理特點之一是肝組織細胞外基質(ECM)過度增多和沉積,也就是出現了ECM的代謝障礙,即合成增加,降解減少。當ECM沉積在竇周隙,必然伴有竇內皮細胞的改變,使得肝細胞與血液之間的通透性出現障礙,影響血流與肝細胞之間的物質交換。大鼠肝組織病理性增生ECM的主要來源細胞是門管區(qū)成纖維細胞〔1〕。在生理情況下,組織內門管區(qū)成纖維細胞是一個較為穩(wěn)定、靜止型的細胞,肝纖維化發(fā)生時,門管區(qū)成纖維細胞受到轉化生長因子(TGF)-β1等細胞因子的刺激,變成活化的門管區(qū)成纖維細胞,產生過多的膠原纖維沉積造成肝血竇毛細血管化,影響肝細胞的新陳代謝。門管區(qū)成纖維細胞主要的產物是細胞外基質中的膠原纖維,除此之外,還可表達基質金屬蛋白酶類(MMPs)及其抑制物。MMPs是鼠類細胞外基質降解酶類,可降解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原纖維〔2〕。金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP-1)是MMPs主要生理抑制物,能調節(jié)MMPs活性。TIMP-1是大多數MMPs的抑制物。門管區(qū)成纖維細胞表達的最重要的細胞因子之一是TGF-β1,TGF-β1是TIMP-1的上游激活物,可以引起TIMP-1的表達量增加,是最重要的促進肝纖維化的細胞因子之一。四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化可以在早期被逆轉,龍膽苦苷是一種被證明治療器官纖維化有效的藥物,秋水仙堿具有明顯的抑制肝纖維化作用,本實驗計劃以秋水仙堿作為陽性對照藥物,研究龍膽苦苷對大鼠肝纖維化的治療效果,并檢測肝組織中TGF-β1和TIMP-1表達水平的影響,進一步闡明龍膽苦苷對肝纖維化的保護作用及其作用機制,為臨床藥物治療肝纖維化提供相關的理論數據和技術支持。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只清潔級雄性SD大鼠,體質量120～150 g。購自遼寧長生生物技術股份有限公司。在佳木斯大學動物實驗中心飼養(yǎng)并進行動物實驗。

1.2材料 龍膽苦苷購自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。CCl4、橄欖油試劑購自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。高級切片石蠟購自上海華玲康復器械廠。秋水仙堿片購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司。蘇木素-伊紅(HE)試劑盒、Masson三色染色液、抗TIMP-1抗體試劑、抗TGF-β1抗體試劑、鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶(SABC-HRP)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3肝纖維化動物模型建立及其計分標準 大鼠正常喂養(yǎng)2 w后隨機分成4組,正常組5只,模型組、秋水仙堿組、龍膽苦苷組各25只。各組普通飼料喂養(yǎng)。模型組、秋水仙堿組和龍膽苦苷組每周腹腔注射兩次40%CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg),正常組和模型組大鼠每周灌胃10 ml/kg的生理鹽水3次,龍膽苦苷組每周灌胃龍膽苦苷(100 mg/kg)3次〔3〕,秋水仙堿組每周灌胃秋水仙堿(0.12 mg/kg)3次,龍膽苦苷與秋水仙堿均溶于生理鹽水中,按10 ml/kg灌胃。實驗中實時監(jiān)測大鼠體質量變化。在第3、5、7周各處死1只大鼠,取肝組織,進行HE染色觀察肝纖維化程度。第8周處死全部大鼠,取肝組織進行HE染色、Masson染色和免疫組化染色。

根據纖維化計分系統(tǒng)〔4〕對各組肝纖維化程度進行比較：計分公式為L+P+2(N+W),L指肝小葉內的肝血竇周圍和中央靜脈周圍,P指門管區(qū),N代表纖維間隔數目,W指纖維間隔寬度。標本內僅一條細纖維間隔,W計為0.5分。本實驗中大鼠的肝組織取材長度都是至少1 cm。光鏡下肝組織無病理變化,計0分;中央靜脈周圍、肝血竇周圍出現纖維間隔,分布局限,數量較少,計1分;彌漫性分布,數量較多,計2分。門管區(qū)擴大,無纖維間隔出現,計1分;門管區(qū)擴大,同時有纖維間隔出現,計2分;門管區(qū)周圍出現肝硬化,計3分。每1 cm長度的肝組織纖維間隔數目少于等于6個,計1分;多于6個,計2分;出現肝硬化,計3分。纖維間隔寬度細計1分;纖維間隔寬,分布疏松,計2分;纖維間隔寬,分布致密,計3分;纖維間隔分布面積≥2/3標本面積計4分。

在免疫組化結果分析中,根據細胞染色強度分為4級,無陽性著色(陰性)計0分,淡黃色(弱陽性)計1分,棕黃色(陽性)計2分,棕褐色(強陽性)計3分;根據陽性細胞百分比評為4級,≤25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分,將兩項評分相乘得出最終積分結果〔5〕。

1.4HE染色 常規(guī)HE染色。光鏡下觀察各組大鼠肝組織的顯微形態(tài)結構變化。

1.5Masson染色 光鏡下分析各組大鼠肝組織纖維間隔的數目與寬度及纖維間隔分布情況。

1.6免疫組織化學染色 烤片;脫蠟和水化;抗原修復;細胞膜通透;滅活內源性過氧化物酶;正常血清封閉;滴加第一抗體抗TGF-β1抗體試劑〔用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋為1∶100〕、抗TIMP-1抗體試劑(用PBS稀釋為1∶100)20 μl,37 ℃孵育2 h;滴加生物素化第二抗體孵育;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。重點觀察各組TGF-β1和TIMP-1的陽性表達細胞種類及位置,比較各組肝組織TGF-β1和TIMP-1表達。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS29.0軟件進行F檢驗和t檢驗。

2 結 果

2.1各組肝纖維化程度比較 正常組肝組織無纖維化,與正常組相比,模型組肝組織肝小葉結構被破壞,大量纖維間隔形成,肝纖維化程度計分顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,秋水仙堿組與龍膽苦苷組肝纖維化程度較模型組顯著改善(P<0.05);秋水仙堿組與龍膽苦苷組肝纖維化程度計分比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組肝纖維化程度計分及免疫組化中TGF-β1和TIMP-1表達比較

2.2各組肝組織形態(tài)變化 光鏡下,正常組肝細胞索圍繞中心靜脈呈放射狀排列,未見病變。模型組大量增生膠原纖維向肝小葉內穿插,形成較寬大的纖維間隔,從中心靜脈通過肝血竇到門管區(qū)或從門管區(qū)到門管區(qū)或從中心靜脈到中心靜脈,即形成橋接纖維化,出現彌漫的纖維組織增生,廣泛的纖維間隔分割肝小葉。纖維間隔中可見大量成纖維細胞。肝細胞腫脹,肝細胞索增厚,肝實質結構呈現不規(guī)則,且出現小葉內少數幾個肝細胞壞死,即出現點狀壞死,可見中心靜脈旁有淋巴細胞浸潤。與模型組相比,龍膽苦苷組和秋水仙堿組纖維組織明顯減少,且纖維間隔變窄,纖維間隔中成纖維細胞明顯減少。肝細胞變性、炎癥得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組肝組織形態(tài)(×100)

2.3各組肝組織TGF-β1、TIMP-1表達 光鏡下,正常組中無陽性著色,模型組中TGF-β1和TIMP-1廣泛表達在門管區(qū)、肝血竇周圍及纖維間隔中,門管區(qū)成纖維細胞是主要的表達細胞,表達強度為棕褐色(強陽性),陽性細胞百分比為51%～75%,其中肝細胞出現明顯小泡型脂肪變,中央靜脈及肝血竇出現不同程度的擴張。秋水仙堿組與龍膽苦苷組TGF-β1和TIMP-1大部分分布于門管區(qū)及纖維間隔中,陽性表達范圍與模型組相比明顯減弱,陽性細胞百分比為25%～50%。見圖2。經免疫組化檢測結果顯示：TGF-β1和TIMP-1在正常組肝組織中無表達,在模型組中表達強陽性,在秋水仙堿組、龍膽苦苷組中的表達量較模型組顯著下降(P<0.05);秋水仙堿組與龍膽苦苷組表達情況相比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

圖2 各組肝組織TGF-β1、TIMP-1表達(免疫組織化學染色,×200)

3 討 論

光鏡下可見門管區(qū)及其周圍膠原纖維增生,并且沿肝血竇散在分布,互相連接,門管區(qū)及其周圍有大量成纖維細胞浸潤,門管區(qū)附近的肝細胞最先獲得營養(yǎng)物質和氧氣的供應,細胞代謝極為活躍,門管區(qū)成纖維細胞增生活躍的原因,早期主要源于門管區(qū)浸潤的巨噬細胞旁分泌的TGF-β1,中晚期則主要源于其自分泌的TGF-β1,所以可以說TGF-β1是造成肝纖維化嚴重的重要原因之一〔6〕。在肝纖維化中,增生的膠原纖維是過度沉積ECM的最主要成分,尤其是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原纖維,即Masson染色中所見的纖維間隔〔7〕。纖維間隔的出現是肝纖維化診斷的金標準〔8〕。

一般慢性肝臟病變會隨著肝纖維化程度的加重,纖維間隔的數目和寬度會相應地增加,并且纖維間隔波及范圍會從門管區(qū)逐漸深入到小葉內竇周區(qū)乃至中央靜脈區(qū)〔9〕。本實驗中,大鼠肝纖維化形成區(qū)域主要集中在門管區(qū)及其周圍區(qū)域,造成大量門管區(qū)成纖維細胞的活化,活化后的門管區(qū)成纖維細胞合成ECM的能力顯著提高〔10〕。TGF-β1和TIMP-1的主要來源細胞之一就是活化的門管區(qū)成纖維細胞〔11〕。通過藥物影響活化的門管區(qū)成纖維細胞,干預其表達TGF-β1和TIMP-1的作用,實現對肝纖維化的預防乃至治療作用是本實驗的中心主題。

秋水仙堿可以抑制ECM合成與分泌,能抑制肝臟纖維化,又能促進纖維化基質降解,可以解聚細胞骨架,抑制細胞的分裂增殖,在本實驗中可以抑制活化的門管區(qū)成纖維細胞的增殖分裂,達到減少TGF-β1和TIMP-1的表達的作用〔12〕。王國英等〔13〕研究提示龍膽苦苷有明顯抗CCl4損肝及保肝作用。龍膽苦苷對CCl4誘導的肝纖維化大鼠具有一定保護肝臟功能等〔14〕。

門管區(qū)成纖維細胞可表達多種MMPs和TIMPs,具有明顯的隨時間變化的程序性表達,即早期主要表達產物是MMPs,但沒有TIMPs。隨病變時間發(fā)展,主要表達產物變?yōu)門IMPs〔15〕。在肝纖維化形成后,TIMP-1及其上游激活物TGF-β1〔16〕是門管區(qū)成纖維細胞的主要表達產物,且在門管區(qū)成纖維細胞之間彼此作用,形成惡性循環(huán)〔17〕,TGF-β1會刺激門管區(qū)成纖維細胞合成大量的ECM〔18〕,且會抑制ECM降解酶〔19〕,是最重要的促纖維化因子之一〔20～22〕。本實驗提示龍膽苦苷與秋水仙堿均具有抑制成纖維細胞增殖,減少膠原纖維沉積的作用效果,且可能是通過減少TGF-β1和TIMP-1的表達水平的作用機制實現的。

感謝黑龍江省北藥與功能食品特色學科項目、微生態(tài)免疫調節(jié)網絡與相關疾病重點實驗室的大力支持。