馬靜，韓黎曉，劉龍龍，張華*

1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）；2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院（錫林浩特 026000）

水飛薊油是一種從干燥水飛薊種子中提取出來的新型植物食用油，作為提取水飛薊素的副產(chǎn)品，并未得到充分開發(fā)利用[1]。因此，有必要區(qū)分不同提取方法水飛薊油的揮發(fā)性有機(jī)化合物的組成和鑒定質(zhì)量優(yōu)劣。

水飛薊油的提取方法主要有機(jī)械壓榨法、水代法、生物酶輔助提取油法等[2-4]。機(jī)械壓榨法會降低食用價值[5]，水代法操作難度大[6]，超臨界萃取和臨界萃取對設(shè)備要求高[7-8]。生物酶輔助提取油法通過酶降解細(xì)胞壁從而釋放油脂，得到的油脂品質(zhì)好、得率高[9]。

由于水飛薊油油脂的質(zhì)量優(yōu)劣不濟(jì)，近年來雖然也有將電子鼻技術(shù)[10-11]、紅外光譜[12]、核磁共振[13]等技術(shù)區(qū)分油脂質(zhì)量，但很難從分子的角度判別油脂質(zhì)量。胡謙等[14]采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)通過對甘油酯的分析，從而對壓榨油和浸出油進(jìn)行鑒別；Kurata等[15]通過電噴霧電離質(zhì)譜快速鑒別42種植物油的脂肪酸組成。

基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPMEGC-MS）用于區(qū)分酶法提取、溶劑提取和壓榨水飛薊油的揮發(fā)性有機(jī)化合物的組成和鑒定質(zhì)量優(yōu)劣研究尚未見諸報道。因此，試驗(yàn)基于HS-SPME-GC-MS技術(shù)，比較不同提取方法的水飛薊油的揮發(fā)性化合物。結(jié)合無監(jiān)督的多變量統(tǒng)計方法PCA、有監(jiān)督的多變量統(tǒng)計方法PLS-DA和灰度關(guān)聯(lián)分析法區(qū)分不同方法提取的水飛薊油，并確定其質(zhì)量優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水飛薊籽（安徽亳州鴻碩生物科技有限公司）；冷榨水飛薊油（延邊遠(yuǎn)山油脂有限公司）。

無水乙醇、正己烷，均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

QP2010 Plus氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源，日本島津公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭（美國Supelco公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水飛薊油的制備

取500 g水飛薊籽放入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后過0.180 mm（80目）篩，取100 g水飛薊籽粉末與300 mL溶液（正己烷-無水乙醇2∶1，V/V）混合置于1 000 mL錐形瓶中，添加3 mg/mL纖維素酶，在pH 4.5，45 ℃反應(yīng)120 min后，于25 ℃恒溫?fù)u床振蕩提取1 h，過濾，于55 ℃保持旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，轉(zhuǎn)移至樣品保存瓶中，氮?dú)獯蹈扇軇?，得到水飛薊油樣品A（SMOA）。添加相同量正己烷后，在25 ℃搖床反應(yīng)2 h后，重復(fù)上述操作，得到水飛薊油樣品B（SMOB）。另外，冷榨水飛薊油樣記為C（SMOC）。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確移取2.0 g油樣置于10 mL帶有隔墊的瓶蓋的頂空瓶中，密封，在60 ℃條件下攪拌平衡10 min，通過隔墊將已老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，吸附60 min，待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.3.3 色譜條件

DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣方式為不分流，載氣為氦氣（He），柱流速1 mL/min，吹掃流量3.0 mL/min，分流比50∶1。升溫程序：起始溫度 40 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至200 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源（EI）溫度200 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間2 min，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍（m/z）40～550。利用質(zhì)譜譜庫為NIST08和NIST08s質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，結(jié)果選擇匹配度≥95%的物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Microsoft Excel 2016數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，運(yùn)用面積歸一化法求得各揮發(fā)性成分的相對含量，將Metabioanalysis 5.0用于數(shù)據(jù)分析、PCA和PLS-DA模型的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的水飛薊油中揮發(fā)性化合物的GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS對不同提取方式的水飛薊油的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行分析和鑒定，其結(jié)果如表1所示。共確定揮發(fā)性有機(jī)物43種，其中主要包括酯類9種、酸類4種、醇類6種、烷烴類12種、烯烴2種，醛類2種、吡嗪1種、其他類7種。3種樣品中SMOA的香氣最為濃郁，而SMOC的香氣最淡。SMOA中含有較高的4-羥基丁酸乙酰酯，4-羥基丁酸內(nèi)酯和N-羥基苯甲酸甲酯等酯類物質(zhì)，這類物質(zhì)有濃郁的麥香和奶油的香氣。但濃度一定時，感覺閾值越低的化合物越容易被感知；感覺閾值一定時，濃度越高的化合物越容易被感知。從某一物質(zhì)的含量判斷其是否為油脂中主要香氣成分不可靠，因此需進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，排除眾多化學(xué)信息共存時發(fā)生互相重疊的現(xiàn)象，根據(jù)主成分因子在不同樣本中不同的貢獻(xiàn)率從而評價樣本之間的規(guī)律性和差異性[21-22]。

表1 水飛薊油易揮發(fā)性有機(jī)化合物相對含量

2.2 不同提取方法的水飛薊油中揮發(fā)性化合物的GC-MS分析

2.2.1 基于PCA對不同提取方法的水飛薊油的區(qū)分

隨著信息技術(shù)的不斷發(fā)展，多元統(tǒng)計技術(shù)被廣泛應(yīng)用于油脂各個領(lǐng)域。利用水飛薊油中有機(jī)揮發(fā)物含量進(jìn)行PCA，如圖1所示。共獲得5個PC，累計R2=0.81，Q2=0.63，表明該模型擬合程度較好，預(yù)測能力較好，能夠很好地顯示樣品間的差異，PC1的方差貢獻(xiàn)率為85.2%，PC2的方差貢獻(xiàn)率為9.9%，2個主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)95.1%，可以很好地代表樣品的所有信息。從樣品的離散和聚集程度上看，SMOA在PC1上與SMOB和SMOC有很大的區(qū)分，無重疊部分，PCA屬于無監(jiān)督分析方法，不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無關(guān)的隨機(jī)誤差，因此，并不能直接區(qū)分不同提取方法的水飛薊油，因此，采用有監(jiān)督的PLS-DA進(jìn)行進(jìn)一步研究。PLS-DA是有監(jiān)督的分析，它可以彌補(bǔ)PCA的不足，消除組內(nèi)差異，強(qiáng)化組間差異，量化特征化合物造成組分差異的程度[23]。建立PLS-DA模型前，為調(diào)整系統(tǒng)的樣本之間的差異對樣本進(jìn)行總合歸一化處理，數(shù)據(jù)采用log對數(shù)處理。

圖1 基于水飛薊油的PCA得分圖

2.2.2 基于PLS-DA對不同提取方法的水飛薊油的區(qū)分

如圖2（a）所示，采用置換檢驗(yàn)對PLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)100次，以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2，可作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示該模型并未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象（P＜0.01），模型可靠。如圖2（b）所示，驗(yàn)證獲得隨機(jī)的R2和Q2，R2=0.99，Q2=0.97，表明模型不但準(zhǔn)確可靠，且具有良好的預(yù)測能力，可用于解釋不同水飛薊油之前的揮發(fā)性有機(jī)物的差異。圖3為不同提取方法的水飛薊油PLS-DA得分圖，圖3顯示SMOA與SMOB和SMOC存在顯著差異，這一結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致。

圖2 不同水飛薊油的置換檢驗(yàn)圖（a）和置換保留圖（b）

圖3 不同水飛薊油的PLS-DA得分圖

2.2.3 不同水飛薊油的揮發(fā)性特征標(biāo)志物的篩選與分析

基于PLS-DA分析結(jié)果，可用變量重要性投影（variable important for the projection，VIP）可量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻(xiàn)，在統(tǒng)計學(xué)上，一般將VIP值大于1表示在判別過程中具有重要作用，VIP值越大，樣本間差異越大[24]。如圖4所示，共篩選出14種潛在揮發(fā)性標(biāo)志物，其中有酯類4種、醇類2種、烷烴類3種。為更加直觀地觀察不同水飛薊油揮發(fā)性標(biāo)志物，根據(jù)每個揮發(fā)性有機(jī)物的相對含量繪制熱圖，如圖5所示，SMOB和SMOC聚為1類，SMOA單獨(dú)為1類。由圖4可以看出，在VIP值大于1的物質(zhì)中，SMOA中三甲基乙腈、新戊二醇、醋酸2-乙基乙酯、甲環(huán)丁烷和4-羥基丁酸內(nèi)酯含量較高，是區(qū)分其他2組的主要標(biāo)志物。而SMOB中3-甲基3-苯基苯甲酸酯含量較高，是區(qū)分其他2組的重要標(biāo)志物。SMOC中季銨鹽-78, 2-乙基對二甲苯和環(huán)辛四烯含量較高，是區(qū)分其他2組的重要標(biāo)志物。SMOA中酯類物質(zhì)含量較高，且風(fēng)味閾值較低，在SMOA中起著重要的作用，因此SMOA的味道更加濃郁。

圖4 不同提取方法的水飛薊油的VIP圖

圖5 不同方法提取水飛薊油揮發(fā)性標(biāo)志物的熱圖

2.3 灰度關(guān)聯(lián)分析法判別水飛薊油質(zhì)量

灰度關(guān)聯(lián)分析法對系統(tǒng)發(fā)展變化態(tài)勢提供量化的度量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)關(guān)聯(lián)度的結(jié)果比較不同因素對整體樣本的影響[25]。為進(jìn)一步明確3種不同提取方式的水飛薊油的質(zhì)量優(yōu)劣，運(yùn)用灰度關(guān)聯(lián)分析法對VIP值大于1的物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計分析。按式（1）計算。

式中：i=1, 2, 3分別表示SMOA，SMOB和SMOC對14組VIP值大于1的揮發(fā)性標(biāo)志物的數(shù)據(jù)均值化處理。

利用式（2）求得絕對差值。

依據(jù)式（3）求出關(guān)聯(lián)系數(shù)，式中ρ為分辨系數(shù)，取0.5，關(guān)聯(lián)系數(shù)結(jié)果見表2。

表2 關(guān)聯(lián)系數(shù)結(jié)果表

計算出各揮發(fā)物的權(quán)重，將權(quán)重帶入綜合評分式（5）。

不同提取方式的水飛薊油綜合評分見表3。結(jié)果表明，SMOA的揮發(fā)性標(biāo)志物綜合評分最高，說明由酶法提取的水飛薊油氣味最優(yōu)，其次是SMOB，氣味最差的是SMOC，這一結(jié)果水飛薊油的氣味優(yōu)劣與提取方式密切相關(guān)。

表3 不同方式所得水飛薊油揮發(fā)性特征物的綜合評分

3 結(jié)論

采用UPLC-QTOF-MS對不同方法提取的水飛薊油揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行檢測，共分析出43種揮發(fā)性有機(jī)物，其中酯類9種、酸類4種、醇類6種、烷烴類12種、烯烴2種、醛類2種、吡嗪1種、其他類7種。結(jié)合多元統(tǒng)計方法分析得出VIP大于1的揮發(fā)性物質(zhì)14種，對SMOA有重要影響的5種，SMOB中1種、SMOC中3種，SMOA揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量最高，含有較高的4-羥基丁酸乙酰酯、4-羥基丁酸內(nèi)酯和N-羥基苯甲酸甲酯等。結(jié)合灰度關(guān)聯(lián)分析法可知：SMOA關(guān)聯(lián)度0.808，油脂質(zhì)量最佳；SMOB關(guān)聯(lián)度0.711，油脂質(zhì)量次之；SMOC關(guān)聯(lián)度0.703，油脂質(zhì)量最差；說明由酶法提取的水飛薊油氣味最優(yōu)。因此，酶法輔助復(fù)合溶劑提取水飛薊油可最大程度地保留油脂中揮發(fā)性成分，香氣最為濃郁。我國水飛薊油提取率仍較低，應(yīng)用規(guī)模較小，提取出的產(chǎn)品質(zhì)量也較差，因此水飛薊油酶提取法提取及運(yùn)用有著重要意義。