陳旭昕 唐 璐 王 凡 劉 夢 李虎明 韓志海

(1 中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 北京市 100037; 2 北京泰康燕園康復(fù)醫(yī)院老年內(nèi)科, 北京市 102200)

肺泡巨噬細胞是“肺微環(huán)境”中數(shù)量最多的炎癥細胞,其作為機體固有免疫系統(tǒng)的“第一道防線”,在諸多肺部疾病(如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等)中發(fā)揮著重要作用[1-2]。極化是決定巨噬細胞功能狀態(tài)最重要的亞細胞事件,調(diào)控肺泡巨噬細胞的極化方向是治療炎癥失控性疾病的潛在方案[3-4]。細胞膜調(diào)控蛋白Paralemmin-3(PALM3)是Paralemmin蛋白家族成員之一,我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)PALM3表達于巨噬細胞系NR8383細胞的細胞膜,調(diào)控PALM3表達可以影響巨噬細胞的炎癥反應(yīng)[5],但PALM3能否調(diào)控巨噬細胞的極化方向目前尚未見文獻報告。因此,本研究擬在體外誘導(dǎo)NR8383細胞極化為M1型肺泡巨噬細胞和M2型肺泡巨噬細胞,比較不同極化狀態(tài)下NR8383細胞中PALM3的表達差異,并利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)下調(diào)PALM3在NR8383細胞中的表達,觀察下調(diào)PALM3表達對NR8383細胞極化方向的影響,以期為巨噬細胞極化失衡相關(guān)疾病的診療提供更多的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 大鼠肺泡巨噬細胞系NR8383細胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。Control-siRNA、PALM3-siRNA、抗大鼠PALM3多克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司(批號分別為sc-37007、sc-97537、sc-248213),TRIzol裂解液(批號:12183555CN)、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000和Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基購于Invitrogen 公司(批號分別為11668019、31985062),脂多糖(E.coil 0111:B4)購于Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(批號:297-473-0),Ham′s F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司(批號分別為21127022、10100-147-FBS),大鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-10 ELISA試劑盒購自R&D Systems公司(批號分別為RTA00、R1000),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、細胞總蛋白提取試劑盒、Cy3標(biāo)記的相應(yīng)二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗、增強型ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號分別為C1002、P0013、A0502、A0181、P0018S),反轉(zhuǎn)錄試劑(TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit)及實時熒光定量PCR試劑(SYBR Green qPCR Master Mix-SYBR Advantage)購自寶生物工程(大連)有限公司(批號分別為RR037A、639676)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):在37.0 ℃、5% CO2、95%濕度條件下,將NR8383細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基,每隔1 d換液1次,2～3 d傳代1次。取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫熒光法檢測NR8383細胞中PALM3的表達:將對數(shù)生長期NR8383細胞按3×106個/孔的密度接種至鋪有載玻片的6孔板中,按照前述細胞培養(yǎng)方案培養(yǎng)細胞。待細胞融合為70%時吸取培養(yǎng)基終止培養(yǎng),加入含4%多聚甲醛的PBS室溫固定20 min。用含100 mmol/L甘氨酸的PBS清洗后,加入含0.3% Triton X-100的PBS處理細胞20 min。用PBST潤洗細胞3次,滴加牛血清白蛋白封閉液后于室溫下封閉30 min。加入稀釋后(1 ∶100)的抗大鼠PALM3多克隆抗體,4 ℃孵育過夜。用PBS充分洗脫后再在載玻片上滴加Cy3標(biāo)記的二抗,避光孵育2 h,DAPI 染核。用PBST潤洗3 次,滴加防熒光猝滅劑后,蓋上蓋玻片并封片,在熒光顯微鏡(Leica公司,型號:DM2500)下觀察并拍照。

1.2.3 細胞分組與處理:(1)按照1.2.2的方法將NR8383細胞接種至24孔板中,待細胞融合為70%時,分別給予100 ng/mL脂多糖、20 ng/mL IL-4刺激12 h[6],然后更換含10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,經(jīng)脂多糖、IL-4刺激的NR8383細胞分別被認定為M1型、M2型肺泡巨噬細胞。將未經(jīng)干預(yù)的正常NR8383細胞作為M0型肺泡巨噬細胞。提取M0型、M1型和M2型肺泡巨噬細胞的總RNA和總蛋白,用實時熒光定量PCR、Western blot分別檢測PALM3的mRNA、蛋白相對表達水平,每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。(2)按照1.2.2的方法將NR8383細胞接種至24孔板中,待融合度達70%時用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將NR8383細胞分為Control-siRNA組、PALM3-siRNA組和正常對照組進行實驗。按照說明書中的操作步驟,用50 μL Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基分別稀釋20 pmoL Control-siRNA、20 pmoL PALM3-siRNA及1μL LipofectamineTM2000,再將siRNA和LipofectamineTM2000均勻混合,共同孵育20 min。然后將含Control-siRNA、PALM3-siRNA的混合液分別加入Control-siRNA組、PALM3-siRNA組的NR8383細胞,在37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下孵育6 h后,更換為含10%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。正常對照組NR8383細胞除常規(guī)換液外,不給予其他額外操作。取3組部分NR8383細胞,用實時熒光定量PCR、Western blot分別檢測PALM3的mRNA、蛋白相對表達水平;取3組剩余細胞,分別給予100 ng/mL脂多糖或20 ng/mL IL-4刺激12 h后,收集上清液和NR8383細胞,采用ELISA檢測上清液中TNF-α及IL-10含量,采用實時熒光定量PCR檢測NR8383細胞中CD80、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD206、精氨酸酶1(arginase 1,ARG1)的mRNA相對表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測PALM3、CD86/iNOS、CD206/ARG1 mRNA相對表達水平:收集經(jīng)過上述分組處理的NR8383細胞,使用PBS充分沖洗細胞后,加入TRIzol裂解液提取總RNA,然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書制備cDNA。參照實時熒光定量PCR 試劑說明書進行檢測,所使用的儀器為QIAGEN公司Rotor Gene 3000型實時熒光定量PCR儀。PCR反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、330 ng/μL的上下游引物各0.5 μL、2×SYBR Green 反應(yīng)液10 μL,加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 10 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40個循環(huán);溶解曲線溫度為65 ℃～95 ℃,每5 s增加0.5 ℃,讀板。以GAPDH為內(nèi)參。引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計及合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測PALM3蛋白相對表達水平:收集經(jīng)過上述分組處理的NR8383細胞,利用細胞總蛋白提取試劑盒提取各組NR8383細胞總蛋白,采用Bradford法測定總蛋白濃度,取等量總蛋白行SDS-PAGE,經(jīng)半干電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,將PVDF膜放入封閉袋中,然后在封閉袋中加入由TBST配制的5%脫脂奶粉封閉液,37 ℃放置2 h后,加入稀釋后(1 ∶500)的抗大鼠PALM3多克隆抗體10 μL,4 ℃放置過夜。次日將膜取出,用TBST洗膜3次(10 min/次)后,再放入另一個潔凈的封閉袋中,加入相對應(yīng)的5%脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記二抗(1 ∶2 500)10 μL,37 ℃放置2 h。用增強型ECL發(fā)光試劑盒顯影、曝光后,使用AlphaImager 2200型成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司)掃描,用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析。

1.2.6 ELISA檢測上清液TNF-α及IL-10含量:收集經(jīng)過上述分組處理的細胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA檢測TNF-α及IL-10含量,參照說明書進行操作。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NR8383細胞中PALM3的表達情況 免疫熒光檢測結(jié)果提示,PALM3在NR8383細胞中有表達,且主要分布于NR8383細胞的細胞膜上,見圖1。

圖1 NR8383細胞中PALM3的免疫熒光檢測結(jié)果(×200)

2.2 3種肺泡巨噬細胞中的PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平的比較 M1型肺泡巨噬細胞、M0型肺泡巨噬細胞、M2型肺泡巨噬細胞中PALM3的mRNA和蛋白相對表達水平依次降低(P<0.05),見表2和圖2。

圖2 PALM3 蛋白在M0型、M1型及M2型肺泡巨噬細胞中的表達情況

表2 3種NR8383肺泡巨噬細胞中PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.3 下調(diào)PALM3表達對NR8383細胞中PALM3 mRNA和蛋白表達水平的影響 PALM3-siRNA組NR8383細胞中PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平低于正常對照組及Control-siRNA組(P<0.05),而正常對照組及Control-siRNA組上述指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示轉(zhuǎn)染成功,見表3和圖3。

圖3 3組NR8383細胞中的PALM3 蛋白表達情況

表3 3組NR8383細胞中PALM3的mRNA和蛋白相對表達水平比較(x±s)

2.4 下調(diào)PALM3表達對NR8383細胞極化為M1型肺泡巨噬細胞及分泌促炎因子的影響 經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA及脂多糖刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M1型表面標(biāo)志物CD86和iNOS的mRNA相對表達水平下調(diào),上清液TNF-α含量降低 (P<0.05),見表4。

表4 3組NR8383細胞中CD86和iNOS mRNA相對表達水平及上清液TNF-α含量的比較(x±s)

2.5 下調(diào)PALM3表達對NR8383細胞極化為M2型肺泡巨噬細胞及抗炎因子的影響 經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA及IL-4刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M2型表面標(biāo)志物CD206和ARG1 mRNA相對表達水平上調(diào),上清液IL-10含量升高(P<0.05),見表5。

表5 3組NR8383細胞中CD206和ARG1 mRNA相對表達水平及上清液IL-10含量的比較(x±s)

3 討 論

成熟的巨噬細胞在各種因素下出現(xiàn)表型及形態(tài)變化,即巨噬細胞的極化現(xiàn)象,不同極化狀態(tài)的巨噬細胞在維持免疫穩(wěn)態(tài)及宿主防御中起著不同的作用[7]。肺泡巨噬細胞具有較強的可塑性和功能異質(zhì)性,容易受到表觀遺傳學(xué)和免疫代謝微環(huán)境等因素的影響而分化為具有不同功能表型的巨噬細胞[8-9]。M1/M2二分法是巨噬細胞極化經(jīng)典的分型方式,M1型巨噬細胞具有強大的促炎及抗原提呈能力,對病原體及腫瘤發(fā)揮宿主免疫清除功能[10];M2型巨噬細胞具有抗炎、促進傷口愈合和纖維化、修復(fù)組織、促進腫瘤生長和浸潤的作用[11-12]。M1型巨噬細胞過度浸潤時可分泌大量一氧化氮、活性氧簇、IL及TNF-α等因子從而引起強烈的炎癥反應(yīng),同時其可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9等因子從而降解細胞外基質(zhì),引發(fā)更多炎癥細胞浸潤到損傷組織周圍而加重炎癥反應(yīng)[13]。促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)變,增加損傷組織中M2型巨噬細胞的數(shù)量可緩解炎癥反應(yīng)從而改善疾病的預(yù)后[14]。因此,調(diào)控巨噬細胞的極化方向是治療炎癥失控性疾病的潛在方案。

巨噬細胞極化是多種因子相互作用的過程,受胞內(nèi)多種信號分子及其通路的調(diào)控[15]。PALM3屬于Paralemmin蛋白家族,于1992年首次在非洲爪蛙中發(fā)現(xiàn),也被稱為Xlgv7/Xlcaax-1[16]。本研究結(jié)果顯示,PALM3在肺泡巨噬細胞系NR8383細胞中有表達,主要定位于細胞膜上,且其在不同極化狀態(tài)的肺泡巨噬細胞中的表達存在差異,在M1型肺泡巨噬細胞中呈現(xiàn)高表達,而在M2型肺泡巨噬細胞中呈現(xiàn)低表達,提示PALM3的表達豐度與肺泡巨噬細胞極化狀態(tài)有關(guān),PALM3可能成為M1型肺泡巨噬細胞的新型特征性標(biāo)志物,有助于巨噬細胞亞群的分析和鑒定。但鑒于巨噬細胞的高度異質(zhì)性,PALM3分子是否能影響M1/M2型以外的其他巨噬細胞亞群,仍有待進一步研究。

本研究進一步下調(diào)PALM3表達,觀察其對肺泡巨噬細胞極化方向及分泌炎癥因子的影響,結(jié)果顯示,經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA及脂多糖刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M1型表面標(biāo)志物表達水平下調(diào),上清液TNF-α含量降低,這提示PALM3是促進肺泡巨噬細胞發(fā)生M1型極化的重要分子。此外,經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA及IL-4刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞的M2型表面標(biāo)志物表達水平上調(diào),上清液IL-10含量升高(P<0.05)。上述結(jié)果提示下調(diào)PALM3表達可促進肺泡巨噬細胞向M2型極化,有助于抑制促炎因子、促進抗炎因子的釋放。此外,研究表明,PALM3可能與膜蛋白的靶向運輸有關(guān),可能作為“接頭分子”參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。而我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn),PALM3可作為“接頭分子”參與Toll樣受體信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16],但PALM3是否能通過Toll樣受體信號通路調(diào)控肺泡巨噬細胞的極化方向,尚需深入探究。

綜上所述,PALM3定位表達于肺泡巨噬細胞的細胞膜,其表達豐度與NR8383的極化狀態(tài)有關(guān),在M1型肺泡巨噬細胞中呈高表達;下調(diào)PALM3表達可抑制脂多糖誘導(dǎo)的M1型肺泡巨噬細胞極化,同時可促進IL-4誘導(dǎo)的M2型肺泡巨噬細胞極化,有助于抑制促炎因子、促進抗炎因子的釋放。調(diào)控PALM3的表達有望成為治療巨噬細胞相關(guān)炎性疾病的新型靶點。